Техника, получившая название VEGAS, работает в клетках млекопитающих и может создавать полезные новые молекулы в течение нескольких дней, предоставляя ученым мощный новый исследовательский инструмент и потенциальный путь к лучшему лечению различных заболеваний, - пишет eurekalert.org со ссылкой на Cell.
Ученые продемонстрировали эту технику, разработав несколько белков для выполнения конкретных новых задач, каждый раз делая это в течение нескольких дней. Существующие методы направленной эволюции являются более трудоемкими, отнимают много времени, и, как правило, применяются в бактериальных клетках, что ограничивает полезность этой технологии для эволюции белков для использования в клетках человека.
Направленная эволюция - это искусственная, ускоренная версия эволюционного процесса в природе. Идея состоит в том, чтобы сосредоточить эволюционный процесс на одной последовательности ДНК, чтобы он выполнял определенную задачу. Направленная эволюция может быть использована для создания новых терапевтических средств, которые мощно работают для остановки болезней и имеют мало побочных эффектов или вообще не имеют их. Первоначальная научная работа по направленной эволюции получила Нобелевскую премию по химии в 2018 году.
Ранее были разработаны подобные методы направленной эволюции с помощью фагов, но они работали в бактериальной клетке.
Рис. 1. Схема метода «непрерывной эволюции при помощи фагов» (Phage-assisted continuous evolution, PACE), позволяющего получить белок с требуемыми свойствами. В клетку кишечной палочки (Host E. coli cell) добавляют две плазмиды (маленькие кольцевые хромосомы): МP (mutagenesis plasmid) и AP (accessory plasmid). Первая служит для регуляции скорости мутагенеза. Вторая содержит ген (M13 gene III), кодирующий белок pIII, который необходим для размножения вируса-бактериофага (SP, selection phage). Чтобы включить этот ген, в клетке должен находиться белок («эволюционирующий белок», evolving protein), способный связываться с «мишенью» (target) — например, другим белком. Ген эволюционирующего белка (Evolving gene) находится в геноме вируса, которым заражают популяцию бактерий. В такой ситуации размножиться удается только тем вирусам, чей «эволюционирующий ген» кодирует белок, достаточно эффективно связывающийся с мишенью. Эволюция происходит в проточной системе, куда постоянно добавляются новые бактерии (Constant inflow). Скорость потока отрегулирована таким образом, чтобы вирусы успевали размножиться до того, как будут вымыты из резервуара, а бактерии — не успевали. Поэтому эволюционировать могут только гены, находящиеся в геноме вируса.
«То, что мы разработали, является самой надежной системой для направленной эволюции в клетках млекопитающих», - сказал ведущий автор исследования Джастин Инглиш - доктор наук, научный сотрудник кафедры фармакологии в Медицинской школе Университета Северной Калифорнии.
«Научному сообществу давно нужен такой инструмент», - сказал старший автор исследования Брайан Л. Рот, доктор медицинских наук, заслуженный профессор Майкла Хукера на кафедре фармакологии Медицинской школы Университета Северной Калифорнии. - Мы считаем, что наша методика ускорит исследования и в конечном итоге приведет к улучшению терапии для людей, страдающих от многих заболеваний, в отношении которых нам нужно гораздо более эффективное лечение».
Широкая концепция направленной эволюции не нова. Исследователи применяли ее на протяжении веков при отборе и селекции вариантов животных и растений, имеющих желаемые характеристики, таких как сорта сельскохозяйственных культур с более крупными плодами. Биологи в последние десятилетия также использовали направленную эволюцию на молекулярном уровне в лаборатории, например, путем случайной мутации гена, пока не появится вариант, который обладает желаемым свойством. Но в целом методы направленной эволюции биологических молекул были сложны в использовании и ограничены в их применении.
Новый метод, разработанный Ротом, Инглишем и коллегами, сравнительно быстр, прост и универсален. Он использует вирус Синдбис в качестве носителя гена, подлежащего модификации. Вирус с его генетическим грузом может инфицировать клетки в чашке и мутировать довольно быстро. Исследователи создали условия для того, чтобы процветали только мутантные гены - те, которые кодируют белки, способные выполнять в клетках желаемую функцию, такую как активация определенного рецептора или включение определенных генов. Поскольку система работает в клетках млекопитающих, ее можно использовать для выработки новых белков человека, мыши или других млекопитающих, которые было бы обременительно или невозможно генерировать с помощью традиционных методов на основе бактериальных клеток.
Инглиш и его коллеги называют новую систему VEGAS (Viral Evolution of Genetically Actuating Sequences) – система для вирусной эволюции генетически активируемых последовательностей. В начальной демонстрации лаборатория Рота модифицировала белок, называемый трансактиватором тетрациклина (tTA), который работает как переключатель активации генов и является стандартным инструментом, используемым в биологических экспериментах. Обычно tTA перестает работать, если встречается с антибиотиком тетрациклином или близкородственным доксициклином, но исследователи разработали новую версию с 22 мутациями, которая позволяет tTA продолжать работать, несмотря на очень высокие уровни доксициклина. Процесс занял всего семь дней.
«Чтобы понять, насколько это эффективно, учтите, что раньше метод направленной эволюции млекопитающих, применяемый к трансактиватору тетрациклина, требовал четыре месяца, чтобы получить только две мутации, которые придают лишь частичную нечувствительность к доксициклину», - сказал Инглиш.
Затем ученые применили VEGAS к общепринятому типу клеточных рецепторов, называемых G-белок-связанными рецепторами (G-protein-coupled receptors). На клетках человека находятся сотни различных GPCR, и многие из них являются целями современных лекарственных средств для лечения широкого спектра заболеваний. Как именно данный GPCR меняет форму, когда он переключается из неактивного состояния в активное, представляет большой интерес для исследователей, пытающихся разработать более точные способы терапии. Инглиш и его коллеги использовали VEGAS для быстрой мутации малоизученного GPCR, называемого MRGPRX2, чтобы он всегда оставался активным.
«Идентификация мутаций, которые произошли во время этой быстрой эволюции, помогает нам впервые понять ключевые области в рецепторном белке, участвующие в переходе в активное состояние», - сказал Инглиш.
Команда продемонстрировала потенциал VEGAS для более непосредственного руководства разработкой лекарств. Они использовали VEGAS для быстрого развития небольших биологических молекул, называемых нанотелами, которые могут активировать различные GPCR, в том числе рецепторы серотонина и дофамина, которые находятся в клетках головного мозга и являются мишенью для многих психиатрических препаратов.
В настоящее время команда использует VEGAS для разработки высокоэффективных инструментов редактирования генов, потенциально для лечения генетических заболеваний, а также для создания нанотел, которые могут нейтрализовать гены, вызывающие рак.
Источник: Научная Россия
