Рис. 1. Схема метода «непрерывной эволюции при помощи фагов» (Phage-assisted continuous evolution, PACE), позволяющего получить белок с требуемыми свойствами. В клетку кишечной палочки (Host E. coli cell) добавляют две плазмиды (маленькие кольцевые хромосомы): МP (mutagenesis plasmid) и AP (accessory plasmid). Первая служит для регуляции скорости мутагенеза. Вторая содержит ген (M13 gene III), кодирующий белок pIII, который необходим для размножения вируса-бактериофага (SP, selection phage). Чтобы включить этот ген, в клетке должен находиться белок («эволюционирующий белок», evolving protein), способный связываться с «мишенью» (target) — например, другим белком. Ген эволюционирующего белка (Evolving gene) находится в геноме вируса, которым заражают популяцию бактерий. В такой ситуации размножиться удается только тем вирусам, чей «эволюционирующий ген» кодирует белок, достаточно эффективно связывающийся с мишенью. Эволюция происходит в проточной системе, куда постоянно добавляются новые бактерии (Constant inflow). Скорость потока отрегулирована таким образом, чтобы вирусы успевали размножиться до того, как будут вымыты из резервуара, а бактерии — не успевали. Поэтому эволюционировать могут только гены, находящиеся в геноме вируса.
Генетически модифицированные растения, защищенные от насекомых-вредителей безвредными для других животных бактериальными токсинами, позволяют резко увеличить урожайность, но ненадолго: насекомые быстро приспосабливаются к токсинам. Чтобы на равных участвовать в эволюционной гонке вооружений с вредителями, необходимо научиться разрабатывать новые токсины, обладающие таким же узким действием. Американские биоинженеры придумали методику, позволяющую в кратчайшие сроки получать новые токсины, опасные только для определенной группы насекомых. Методика основана на быстрой эволюции вирусов-бактериофагов, сконструированных таким образом, чтобы для выживания им был необходим белок, обладающий нужными человеку свойствами.
Использование генетически модифицированных растений в сельском хозяйстве неуклонно ширится, несмотря на сохраняющуюся кое у кого предвзятость и необоснованные страхи. На сегодняшний день одним из самых простых и многообещающих подходов к повышению урожайности является внедрение в геном растений генов почвенной бактерии Bacillus thuringiensis, кодирующих белковые токсины, опасные только для определенных групп насекомых и больше ни для кого. Эти токсины, обобщенно называемые Bt-токсинами, связываются с рецепторами на поверхности клеток средней кишки насекомого и способствуют образованию дыр в клеточных мембранах, что приводит к гибели клеток, а затем и всего насекомого. Каждый Bt-токсин распознает только «свой» рецептор и поэтому безопасен для животных, у которых такого рецептора нет.
ГМ-растения со встроенными генами Bt-токсинов используются в сельском хозяйстве уже около 20 лет. На сегодняшний день ими засеяно 420 млн га. Их использование существенно повысило продуктивность сельскохозяйственного производства.
Однако насекомые быстро приспосабливаются практически к любым ядам, в том числе и к Bt-токсинам. Устойчивые насекомые начинают появляться всего через 5–6 лет после внедрения нового трансгенного сорта, а иногда еще быстрее. Чтобы не проиграть в эволюционной гонке вооружений, необходимо развивать «прикладную эволюционную биологию».
Уже разработано несколько стратегий, позволяющих замедлить распространение устойчивости в популяциях вредителей. Один из подходов — засеивать небольшие участки незащищенными растениями, чтобы на этих участках отбор благоприятствовал насекомым, не имеющим средств защиты от яда. Дело в том, что выработка устойчивости к яду как правило (хотя и не всегда) сопровождается негативными побочными эффектами, поэтому в конкуренции за не отравленные растения устойчивые насекомые проигрывают неустойчивым. Но это требует от фермеров определенного уровня грамотности и даже альтруизма: не каждый согласится превратить часть своего надела в питомник для вредителей. Другой подход — заставить растение производить сразу несколько разных токсинов, направленных против одних и тех же вредителей. Наконец, можно просто почаще менять токсины. Но где взять столько разных токсинов, каждый из которых к тому же должен обладать узконаправленным действием и не вредить никому, кроме определенной группы насекомых?
Американские биоинженеры из Гарвардского и Корнелльского университетов и компании Монсанто опубликовали в журнале Nature статью, в которой они описывают новый хитроумный метод, позволяющий при помощи искусственной эволюции быстро получать новые модификации Bt-токсинов с требуемыми свойствами.
На поверхности клеток кишечника насекомых имеется много потенциальных мишеней для Bt-токсинов (различных белковых рецепторов), но далеко не все они используются существующими в природе Bt-токсинами. Следовательно, можно попытаться изменить ту часть аминокислотной последовательности токсина, которая служит для распознавания рецептора-мишени, так, чтобы токсин начал связываться с каким-нибудь другим рецептором. В остальном токсин можно оставить без изменений. В результате мы, возможно, получим новый токсин, который будет так же эффективно разрушать мембраны клеток кишечника, но прикрепляться он будет к другим поверхностным белкам этих клеток. Известно, что устойчивость насекомых к Bt-токсинам обычно развивается за счет мутаций, меняющих соответствующий поверхностный белок или вовсе отключающих его экспрессию (без многих белковых рецепторов прожить можно, а вот с продырявленными клетками кишечного эпителия — нельзя). Таким образом, изменив специфичность токсина (заставив его распознавать другой рецептор), можно преодолеть выработанную насекомыми устойчивость.
Но как изменить специфичность токсина? Для этого требуется не одна и не две, а много аминокислотных замен. К сожалению, современные знания о связи аминокислотной последовательности белка с его функциональностью по-прежнему недостаточны, чтобы просто взять и спроектировать нужный белок на бумаге или компьютере. Поэтому наилучшим методом остается «дарвиновская эволюция в пробирке», то есть случайные мутации и отбор. Природа ведь тоже не смогла изобрести ничего лучшего. Тот же общий принцип использует и иммунная система позвоночных для выработки специфических антител, избирательно связывающихся с определенным антигеном.
Чтобы получить новые токсины, авторы модифицировали недавно изобретенную технологию «непрерывной эволюции при помощи фагов» (phage-assisted continuous evolution, PACE). Суть метода PACE в том, что в бактерию вставляют маленькую дополнительную хромосому (плазмиду, на рис. 1 она обозначена буквами AP), содержащую ген вирусного белка pIII (M13 gene III). Этот белок необходим для размножения вируса-бактериофага. При этом регуляторную область данного гена конструируют таким образом, чтобы ген включался только при наличии в клетке белка, обладающего определенными свойствами (Evolving protein на рис. 1). Затем бактерий заражают бактериофагами (SP), не имеющими собственного гена pIII. В геном фагов вставлена генетическая заготовка: ген того самого «эволюционирующего белка», который исследователи хотят изменить путем искусственной эволюции (Evolving gene). Всё происходит в проточном резервуаре с постоянным поступлением новых бактерий, которые вымываются оттуда быстрее, чем успевают размножиться. Фаги, однако, размножаются быстрее бактерий, поэтому в системе PACE эволюционируют только вирусные гены, но не бактериальные и не плазмидные. Селективное преимущество получают те фаги, чей «эволюционирующий ген» обеспечивает наиболее эффективное производство белка pIII, закодированного в плазмиде AP. Для регуляции скорости мутагенеза в бактериальные клетки добавляется еще одна плазмида, MP. Она содержит генетическую конструкцию, которая позволяет регулировать темп мутирования, меняя концентрацию сахара арабинозы в среде.
Главное достоинство этой технологии состоит в том, что она позволяет проводить искусственную эволюцию в автоматическом режиме в течение многих поколений подряд. До сих пор разработка новых белков методом искусственной эволюции, как правило, требовала человеческого вмешательства на каждом шаге: сначала нужно размножить исходный ген, внося в него случайные мутации, затем синтезировать белки, отобрать из них лучший, отсеквенировать его ген, снова размножить его с мутациями и т. д. Процесс получался очень трудоемким, и поэтому дело чаще всего ограничивалось лишь несколькими поколениями репликаторов. Между тем для серьезных эволюционных изменений требуется, как правило, много поколений. Ранее удалось отчасти автоматизировать искусственную эволюцию рибозимов, но на эволюцию белков эту технологию перенести трудно. То, что биологи теперь могут заставить вирусы — самые быстро эволюционирующие репликаторы в природе — в автономном режиме «изобретать» нужные человеку белки, это, безусловно, впечатляющее достижение.
Впрочем, система PACE до сих пор не использовалась для получения белков, избирательно связывающихся с другими белками.
Авторы поставили себе целью получить новую модификацию широко используемого в генной инженерии Bt-токсина Cry1Ac, которая связывалась бы с рецептором TnCAD бабочки металловидки серой (Trichoplusia ni) — опасного вредителя. Естественный токсин Cry1Ac, имеющийся у бактерии Bacillus thuringiensis, не связывается с рецептором TnCAD, а бабочки T. ni уже успели выработать устойчивость к этому токсину.
Система PACE была модифицирована следующим образом (рис. 1). В геном бактериофага (SP) в качестве «эволюционирующего гена» вставили ген белка, представляющего собой участок токсина Cry1Ac, служащий для распознавания рецептора хозяйской клетки, к которому присоединена одна из частей (субъединиц) бактериальной РНК-полимеразы. В плазмиду AP перед геном белка pIII (который, как мы помним, необходим для размножения вируса) вставили регуляторную область, содержащую участок ДНК (синий прямоугольник на рис. 1, а), распознаваемый специальным ДНК-связывающим белком (он изображен в виде четырех синих и голубых кружочков на рис. 1, а). В плазмиде также имеется ген, кодирующий этот ДНК-связывающий белок, соединенный с «мишенью» (target) — фрагментом рецептора TnCAD бабочки-вредителя. Таким образом, чтобы запустить экспрессию pIII, белок Cry1Ac, закодированный в геноме фага, должен присоединиться к «мишени». Тогда на пришитом к нему фрагменте РНК-полимеразы соберется вся многокомпонентная бактериальная РНК-полимераза, которая окажется как раз в нужном месте, чтобы осуществить транскрипцию pIII и произвести белок, необходимый для размножения вируса. В итоге размножиться смогут только те вирусы, чей Cry1Ac хоть немного прилипает к TnCAD. Чем сильнее он будет прилипать, тем быстрее будут размножаться вирусы.
Однако рецептор TnCAD настолько мало похож на естественные мишени токсина Cry1Ac, что последний к нему вообще не прилипает, так что отбору поначалу не за что зацепиться. Попытки сразу использовать TnCAD в качестве мишени не увенчались успехом: ни один вирус не сумел размножиться. Тогда авторы изготовили «промежуточную ступеньку» для искусственной эволюции: модифицированный вариант TnCAD, в котором три аминокислоты были заменены таким образом, чтобы ключевой участок белка, распознаваемый Bt-токсинами, стал больше похож на естественные мишени Cry1Ac.
Это помогло, и за 276 часов эволюции (что соответствует такому же числу поколений фагов, поскольку смена поколений у них происходит примерно каждый час) удалось вывести несколько вариантов Cry1Ac, надежно прилипающих к модифицированному TnCAD. После этого мишень заменили на обычный TnCAD, и спустя еще 252 часа были получены варианты Cry1Ac, эффективно связывающиеся с этим рецептором.
От исходного Cry1Ac новые токсины отличаются 10–12 аминокислотными заменами. Это много: получить такие белки без помощи PACE, вручную размножая гены и отбирая белки на каждом шаге, было бы крайне трудно.
Впрочем, это была еще не окончательная победа. Полученные белки связываются с TnCAD, но сохранили ли они свою смертоносность для бабочки-вредителя? Как выяснилось, нет. Эксперименты показали, что новые белки потеряли устойчивость к пищеварительным ферментам гусеницы: они просто-напросто разрушаются в ее кишечнике и почти не оказывают токсического действия.
Данный результат был вполне ожидаемым. Ведь в ходе искусственной эволюции отбор шел только на способность Cry1Ac связываться с рецептором TnCAD, а все остальные свойства белка игнорировались. Чтобы все-таки получить эффективный токсин, авторам пришлось «отменять» закрепившиеся мутации по одной и смотреть, как это повлияет на токсичность. В итоге выяснилось, что на ранних этапах искусственной эволюции, когда в качестве мишени использовался еще не настоящий TnCAD, а его модифицированный вариант, у эволюционирующего Cry1Ac закрепились две аминокислотные замены, которые и сделали белок уязвимым для пищеварительных ферментов гусеницы. Когда исследователи убрали эти замены (то есть вернули соответствующие аминокислоты в исходное состояние), получился эффективный токсин, убивающий любых гусениц T. ni: как устойчивых к исходному Cry1Ac, так и неустойчивых. Смертоносность нового токсина по отношению к устойчивым бабочкам оказалась сопоставима с токсичностью исходного Cry1Ac по отношению к исходным бабочкам, еще не выработавшим устойчивость к Cry1Ac. Таким образом, приобретенную вредителем устойчивость удалось успешно преодолеть. Новый токсин убивает только гусениц T. ni и ряда близких видов бабочек, у которых есть похожий рецептор, но безвреден для всех остальных животных.
Исследование показало, что в вечной битве человека с насекомыми за урожай нам всё-таки есть что противопоставить быстро эволюционирующим вредителям. Поставив себе на службу еще быстрее эволюционирующие вирусы, человечество сможет как минимум на равных участвовать в эволюционной гонке вооружений с насекомыми-фитофагами. Вероятно, теперь производство ГМ-растений с новыми инсектицидными белками можно будет поставить на поток, что позволит значительно увеличить производительность сельского хозяйства в глобальном масштабе. Учитывая, что население Земли уже в середине нынешнего века приблизится к отметке 10 миллиардов, значение новой технологии трудно переоценить.
Источник: ЭЛЕМЕНТЫ БОЛЬШОЙ НАУКИ
