Обычные клетки прекращают делиться после критического укорочения теломер [1]. В стволовых клетках теломеры не укорачиваются [2]. Использование стволовых клеток для борьбы со старением организма кажется очевидным шагом, однако существенных результатов оно не дало. Стволовые клетки также стареют.

Дифференцировка и старение стволовых клеток - это сложный процесс, в котором участвуют как мутационные факторы (мобильные генетические элементы (МГЭ) [3, 4, 5] и мутации, связанные с переходом метил-цитозина в тимин [6, 7]), так и эпигенетические механизмы (метилирование и деметилирование ДНК [8]). В механизме дифференцировки стволовых клеток участвуют метил-ДНК связывающие белки, сайты связывания которых находятся в составе последовательности МГЭ [9]. Эти сайты связывания состоят из CpG-островков, богатых цитозином, который в метилированном виде по нескольким причинам мутирует в тимин [10, 11, 12], что приводит к потере узнавания этих сайтов связывания метил-ДНК связывающими белками. Из-за чего происходит прекращение подавление транскрипции в соседних генах.

Исходя из вышеизложенного, определённому возрасту соответствует определенная мутационная и эпигенетическая картина стволовых клеток, а клонированные животные в своём развитии не отличаются от обычных [13]. Стволовые клетки организма стареют вместе с ним.

Мы хотим проверить в эксперименте омолаживающий эффект стволовых клеток от молодых клонов при пересадке их старым животным. Для этого предполагаем вводить внутривенно сепарированный костный мозг старым крысам от их молодых клонов, что позволит полностью избежать реакции отторжения трансплантируемого костного мозга, крысы были впервые клонированы в 2003 г [14].

Ещё в 1979 году было показано, что введённый внутривенно костный мозг встраивается в свои природные ниши. Планируется периодически вводить внутривенно сепарированный от жировых клеток костный мозг, все типы клеток предшественников, которые содержатся в строме костного мозга [16, 17, 18, 19, 20], а не только предшественники клеток крови, используемые при пересадке костного мозга, плюс при таком методе трансплантации, будут перенесены клетки стволовой ниши, которые могут также модулировать возрастной профиль [21]. Эта манипуляция должна продлить жизнь крысам, если костный мозг вводится регулярно. Кроме естественно состарившихся животных мы будем проводить опыт по омоложению животных, состаренных химиотерапией доксорубицином [22].

Использование чистой линии вместо клонов неприемлемо по причине того, что в чистой линии неизбежно остаётся существенная разница между животными. Так в исследовании What is Whole Genome Shotgun (WGS) инбредных мышей-однопометников показало 985 мутантных участков между 2-мя мышами [23]. 

Показано что Т-клетки здоровых людей распознают до 20% неоантигенов (мутантных белков), а Т-клетки больных раком доноров распознают чуть более 1 % неоантигенов [24].

Таким образом около 1000 тысячи различных мутаций, существует у животных чистой лини от одного помёта, а значит их клетки будут иммуногенными в той или иной степени, что будет препятствовать нормальному функционированию донорских стволовых клеток, а подавление иммунитета само может вызвать гибель животных, что неприемлемо при оценке влияния на продолжительность жизни.

Внутривенно можно также вводить вместе с костным мозгом и cтволовые клетки, взятые из органов и тканей клона. Механически и ферментативно отделённые от органов и тканей. Разделённые с помощью клеточного сортера, используя CD-маркеры стволовых клеток, например, CD34+, CD31-.

Данный метод продления жизни с использованием стволовых клеток самого высокого качества, покажет принципиальную возможность продления жизни у крыс и позволит привлечь необходимые средства на дальнейшее развитие. После подтверждения работоспособности этой технологии. В последующих исследованиях, мы планируем подтвердить мутационные и эпигенетические причины старения стволовых клеток, что наиболее удобно сделать на клонах.

В итоге мы собираемся разработать среду с антимутагенами, для выращивания стволовых клеток в биореакторе вне организма. Эта среда за счёт антимутагенов будет поддерживать стволовые клетки человека в соответствии с требуемым возрастом, то есть с требуемым мутационным и эпигенетическим профилем. Регулярное введение этих клеток внутривенно, обеспечит регенерацию и соответственно продление жизни.

У нашей организации есть полностью укомплектованная лаборатория - виварий, опытный коллектив, который уже в течении 7 лет проводит доклинические исследования лекарственных средств на лабораторных животных.

В целом потребуется грант около 400 тысяч долларов в год в течении 3 лет.

Любые вопросы по почте: alex@bioconsulting.ru 

Чагин Алексей Сергеевич – директор Биоконсалтинг.

Номер карты Сбербанка РФ для пожертвований - 4817 7600 8714 7314

Номер карты Альфа-банка для пожертвований - 4261 0125 5481 2439

Ссылки:

1. Elizabeth H. Blackburn 2000 Telomere states and cell fates
2. E Hiyama and K Hiyama 2007 Telomere and telomerase in stem cells
3. Jason G. Wooda 2016 Chromatin-modifying genetic interventions suppress age-associated transposable element activation and extend life span in Drosophila
4. Jianrong Wang, Glenn J. Geesman Pages 3016-3030 Published online: 01 Sep 2011 Inhibition of activated pericentromeric SINE/Alu repeat transcription in senescent human adult stem cells reinstates self-renewal
5. Nicole G. Coufal1 Nature 460, 1127-1131 (27 August 2009) L1 retrotransposition in human neural progenitor cells
6. Ludmil B. Alexandrov Nature 500, 415–421 (22 August 2013) Signatures of mutational processes in human cancer
7. Ludmil B Alexandrov Nature Genetics 47, 1402–1407 (2015) Clock-like mutational processes in human somatic cells
8. Horvath S. Genome Biol. 2013;14(10):R115. DNA methylation age of human tissues and cell types.

9. Akopov S.B. (2014). The structural-functional analysis of enhancer and insulator systems of transcription regulation. PhD dissertation. The Institute of Bioorganic Chemistry. Moscow.
10. Intrinsic mutagenic properties of 5-chlorocytosine: A mechanistic connection between chronic inflammation and cancer 2015 PNAS
11. An APOBEC cytidine deaminase mutagenesis pattern is widespread in human cancers Nature Genetics 45, 970–976 (2013)

12. Cooper DN1, Mort M, Stenson PD, Ball EV, Chuzhanova NA. Hum Genomics. 2010 Aug;4(6):406-10. Methylation-mediated deamination of 5-methylcytosine appears to give rise to mutations causing human inherited disease in CpNpG trinucleotides, as well as in CpG dinucleotides.
13. Healthy ageing of cloned sheep (2016) K. D. Sinclair, S. A. Corr, C. G. Gutierrez, P. A. Fisher, J.-H. Lee, A. J. Rathbone, I. Choi, K. H. S. Campbell & D. S. Gardner Nature Communications
14. Zhou, Q. et al. Generation of fertile cloned rats using controlled timing of oocyte activation. Sciencexpress, published online, doi:10.1126/science.1088313 (2003).
15. Congdon C.C. Disturbing Our Settled Ways by New Inventions. Exp.Hemat. 1972, vol.22, p.29
16. Щегелъская и др., 2002
17. Woodbury et al., 2000
18. Orlic et al., 2001
19. Petersen et al., 1999
20. Vessey, de la Hall, 2001
21. Роль стволовой ниши в процессах старения организма А. А. Москалёв Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева), 2009, т. LIII, № 3
22. Damodar, G., Smitha, T., Gopinath, S., Vijayakumar, S., and Rao, Y. An evaluation of hepatotoxicity in breast cancer patients receiving injection doxorubicin. Ann. Med. Health Sci. Res. 2014; 4: 74–79
23. Oey, H. et al. Genetic and epigenetic variation among inbred mouse littermates: identification of inter-individual differentially methylated regions. Epigenetics & Chromatin 8, 54-65 (2015)
24. Erlend Strønen et аl. Targeting of cancer neoantigens with donor-derived T cell receptor repertoires. Science 2016