Гликозилирование — присоединение длинных углеводных фрагментов (гликанов) к биологическим молекулам — широко распространенный способ регуляции их функций в живых клетках. Многие белки, созревая в эндоплазматическом ретикулуме и аппарате Гольджи, подвергаются навешиванию таких углеводных «довесков». Еще одной частой мишенью гликозилирования являются липиды. Благодаря гликанам у белков и липидов появляются дополнительные участки, доступные для взаимодействия с другими молекулами, что позволяет расширить спектр молекул, с которыми они могут вступать во взаимодействие. Гликозилирование широко распространено в клетках всех типов во всех трех доменах жизни — эукариотах, бактериях и археях. Однако недавно в журнале Cell появилось интересное сообщение: оказывается, еще одной мишенью гликозилирования являются молекулы РНК! Ранее считалось, что углеводные модификации РНК ограничиваются «навешиванием» одного-двух остатков простых сахаров, но сейчас ученые смогли показать, что к молекулам РНК могут присоединяться и настоящие углеводные «деревья», состоящие из множества остатков моносахаридов. Биологическая роль таких «гликоРНК» пока не установлена.
Рис. 1. Ученые уже давно знают, что гликозилированию — присоединению длинных углеводных «хвостов» (гликанов) — в живых клетках могут подвергаться белки (protein) и липиды (lipid). В недавней работе установлено, что гликозилированию подвержены и малые РНК. Такие «гликоРНК» в большинстве своем локализуются на поверхности клетки.
Одна из важнейших функций углеводов в живых клетках — служить формой запасания энергии. Но этим полезная роль углеводов не ограничивается: многие клеточные белки и липиды несут на себе ковалентно прикрепленные крупные углеводные фрагменты — гликаны, которые представляют собой разветвленные цепочки связанных друг с другом простейших сахаров — моносахаридов (рис. 2).
Рис. 2. Разнообразие гликанов. A — основные моносахариды, встречающиеся в гликанах млекопитающих: галактоза, N-ацетилгалактозамин (N-acetylgalactosamine), N-ацетилглюкозамин, манноза, сиаловая кислота, фукоза. B — гликаны, которые присоединяются к атомам азота (N) в составе остатка аспарагина в белках (N-гликаны), C — гликаны, которые прикрепляются к атомам кислорода (O) в остатках серина и треонина в белках (O-гликаны).
Присоединение углеводных фрагментов — гликозилированием — происходит в основном в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) и аппарате Гольджи (АГ). Важность гликозилирования как для функционирования единичных клеток, так и для организма в целом трудно переоценить. Благодаря углеводным фрагментам наша иммунная система распознает патогенные клетки и раковые клетки, а во время эмбриогенеза происходят нужные для правильного развития межклеточные взаимодействия. Дело в том, что многие клетки нашего организма несут рецепторы обширной группы лектинов, способные специфично распознавать разнообразные углеводные фрагменты, находящиеся на поверхностях других клеток. Например, с помощью лектинов лейкоциты взаимодействуют с клетками эндотелия кровеносного капилляра перед тем, как выйти в ткань в начале локального воспаления. На сегодняшний день ученые не нашли ни одной клетки среди всех трех доменов жизни — эукариот, бактерий, архей — в которой не происходило бы гликозилирование. У млекопитающих гликановые цепи, которые навешиваются на различные белки и липиды, как правило, состоят из 10 ключевых моносахаридов.
Недавно в журнале Cell вышла работа, в которой показано, что еще одной важнейшей мишенью гликозилирования, долгие годы ускользавшей от глаз ученых, являются молекулы РНК. Многообразие РНК — и длинных, и коротких — в клетке огромно, причем ученые регулярно описывают новые виды РНК, выполняющие самые необычные биологические функции. Как же РНК удается быть такими многофункциональными, если они состоят всего лишь из четырех основных строительных блоков — адениновых, урациловых, гуаниновых и цитозиновых нуклеотидов? На самом деле, практически все РНК после синтеза подвергаются разнообразным посттранскрипционным модификациям, которых на данный момент известно больше сотни. Эти модификации включают в себя химические модификации некоторых оснований, довешивание на конец молекулы нуклеотидов, которых нет в ДНК-матрице, и многие другие превращения. К слову, довешивание одного-двух углеводных остатков также считается хорошо описанной посттранскрипционной модификацией. А теперь к этому многообразию превращений добавляется еще и полноценное гликозилирование.
Как вообще можно обнаружить, что какие-то молекулы гликозилированы? Например, можно добавить к живым клеткам в избытке какой-нибудь меченный моносахарид. В течение некоторого времени клетка будет включать эту метку практически во все углеводные цепи, которые она синтезирует, — в том числе и в гликаны. Далее гликаны, несущие меченный моносахарид, а заодно и присоединенные к ним биомолекулы можно будет выявить с помощью специальной химической реакции. Авторы обсуждаемой работы использовали для этих целей N-азидоацетилманнозамин (Ac4ManNAz, рис. 3) — предшественник моносахарида сиаловой кислоты. В качестве метки здесь выступает азидная группа, которая легко выявляется с помощью так называемой клик-реакции (см. Клик-химия).
Рис. 3. N-ацетилманнозамин — предшественник сиаловой кислоты, в который была введена азидная группа
Итак, исследователи добавили Ac4ManNAz в среду к клеткам линии HeLa, чтобы выяснить, а существуют ли вообще в клетке РНК, содержащие гликаны. После инкубации с меченым предшественником из клеток выделили РНК и выявили все молекулы, содержащие азидную группу. Как показали электрофорез в агарозном геле и клик-реакция, среди клеточной фракции РНК присутствует существенная доля высокомолекулярных соединений, несущих азидную метку. Обработка клеточного экстракта ДНКазой — ферментом, расщепляющим ДНК, — никак не сказывалась на силе сигнала, а вот РНКаза сводила его к нулю. Следовательно, клетки, обработанные Ac4ManNAz, действительно включают азидную метку в состав гликановых цепей, которые затем навешиваются на РНК. Наличие гликозилированных РНК тем же способом удалось подтвердить как на других линиях клеток, так и у других видов на примере целых организмов. Ученые вводили мышам Ac4ManNAz внутрибрюшинно, а затем, спустя несколько дней, экстрагировали РНК из их печени и селезенки (из них выделяется больше всего РНК) и увидели уже знакомую картину: высокомолекулярные РНК, несущие меченые азидом гликановые цепи, присутствовали и в этом случае. Вот они, «сладкие» РНК!
На какие РНК клетка навешивает гликаны? Чтобы ответить на этот вопрос, авторы исследования изолировали фракции малых (длиной менее 200 нуклеотидов) и длинных (длиной более 200 нуклеотидов) РНК, и проверили, в какой из них присутствуют гликозилированные РНК (гликоРНК). Оказалось, что обильному гликозилированию подвергаются преимущественно малые РНК, а их низкая электрофоретическая подвижность, из которой был сделан вывод об их высокомолекулярности, обусловлена массивными гликановыми фрагментами.
Но ведь и малых РНК существует множество видов. Какие именно из них гликозилируются? Детальный анализ показал, что гликозилированию подвергаются Y-РНК, малые ядерные РНК, рибосомные РНК, малые ядрышковые РНК, а также транспортные РНК.
Авторы работы продолжили исследование новоявленных гликоРНК и изучили, как устроены гликановые довески, присоединенные к ним. Ac4ManNAz в клетках человека сначала конвертируется в сиаловую кислоту, затем к сиаловой кислоте присоединяется цитозинтрифосфат (ЦТФ) с образованием ЦМФ-сиаловой кислоты, и уже в таком виде сиаловая кислота присоединяется к концам углеводных цепей (рис. 4). С помощью расщепления сиаловой кислоты сиалидазой и ингибирования различных этапов биосинтеза сиаловой кислоты ученые добились того, что сила сигнала от гликоРНК существенно снизилась. Отсюда был сделан вывод, что гликаны, входящие в состав гликоРНК, содержат большое количество остатков сиаловой кислоты.
Рис. 4. Схема преобразования N-ацетилманнозамина в сиаловую кислоту и ее включение в состав углеводной цепи.
Вообще, в клетке есть две системы гликозилирования. Первая присоединяет гликан к атому азота в биомолекуле, поэтому такое гликозилирование называют N-гликозилированием. Вторая прикрепляет углеводную группу к атому кислорода — этот процесс известен как O-гликозилирование. И в первом, и во втором случае на концах цепей гликана может быть сиаловая кислота. Какая из этих систем отвечает за гликозилирование малых РНК?
Ученые показали, что добавление в среду к клеткам ингибитора фермента олигосахарилтрансферазы, задействованной в начальных этапах N-гликозилирования, снижает количество гликоРНК в клетке, причем чем больше ингибитора было добавлено, тем сильнее падает содержание гликоРНК. Ингибиторы ферментов, отвечающих за дальнейший процессинг N-гликозилированных белков, а именно, «подрезание» навешенных углеводных хвостов, также вызывали дозозависимое снижение количества гликоРНК. Таким образом, можно смело заключить, что гликозилированием РНК занимаются те же ферменты, что обеспечивают N-гликозилирование белков.
Для дальнейшего изучения состава гликановых цепей в составе гликоРНК авторы работы воспользовались масс-спектрометрией (как мы помним, пока что им удалось лишь выяснить, что на концах углеводных цепей этих гликанов находится сиаловая кислота). Оказалось, что набор гликанов, которые могут пришиваться к РНК, гораздо уже и менее разнообразен, чем таковой у белков. Исследователи также отметили, что в гликанах, входящих в состав гликоРНК, больше фукозы по сравнению с гликанами, пришитыми к белкам.
Но самым неожиданным свойствам гликоРНК оказалась их внутриклеточная локализация. Исследователи разобрали клетки на «запчасти»: выделили ядра клеток, а также отделили цитозоль от мембранных органелл. Оказалось, что гликоРНК находятся исключительно во фракции мембранных органелл. Дальнейший анализ показал, что, хотя малая доля гликоРНК детектируется во внутреннем пространстве мембранных органелл, большая их часть находится на поверхности мембран. Более того, оказалось, что гликоРНК локализуются не внутри клетки, а в основном на внешней поверхности клеточных мембран.
Молекулы, которые находятся на клеточной поверхности, очень часто оказываются вовлеченными в сложную сеть межклеточных взаимодействий. Так оказалось и с гликоРНК. Ученые показали, что они распознаются не только антителами, «заточенными» на двуцепочечные РНК, но и клеточными рецепторами семейства Siglec, которые тоже находятся на поверхности клеток. Правда, какое значение эти взаимодействия имеют для межклеточной коммуникации, пока остается неизвестным.
Стоит отметить, что авторам работы так и не удалось выяснить, за счет какой именно связи соединяются гликан и РНК, — иными словами, между какими атомами гликана и РНК образуется ковалентная связь. Исследователи полагают, что вряд гликозилированию подвергается уже полностью синтезированная РНК. Скорее всего, гликан пришивается к нуклеотиду до его включения в синтезирующуюся цепочку РНК. Наконец, поскольку в данном исследовании ученые метили только сиаловую кислоту, вполне вероятно, что существует множество разнообразных гликоРНК, углеводная часть которых не содержит остатков сиаловой кислоты. Так что пока нам удалось увидеть лишь малую долю огромного мира гликированных РНК.
Источник: ЭЛЕМЕНТЫ БОЛЬШОЙ НАУКИ
