Российские молекулярные биологи раскрыли роль прокариотических белков-аргонавтов и выяснили точный механизм их работы. Оказалось, что эти белки усиливают противовирусную защиту клетки, усиливая воздействие системы recBCD. Кроме того, исследователи прямо показали существование ДНК-интерференции, которая в перспективе может быть использована для изучения архитектуры геномов. Статья опубликована в Nature.
Структура белка-аргонавта
В конце XX века в ходе рядового эксперимента по генетической модификации было сделано фундаментальное открытие. Ученые пытались усилить окраску петунии, заражая растение вирусными частицами, которые содержали дополнительный ген пигмента. Но вместо усиления окраски она пропала. Позднее оказалось, что в этом виновата РНК-интерференция, а через какое-то время были обнаружены белки-аргонавты (Argonaute) — часть ее механизма. Эти белки могут связываться с короткими фрагментами двухцепочечной РНК, после чего ищут в клетке молекулы с такой же последовательностью и уничтожают их. Получив «целеуказание» на атаку вводимого материала, белки-аргонавты уничтожили также и родные гены пигмента, поскольку они были тождественны.
Оказалось, что Argonaute есть в 60 процентах эукариот, чей геном был секвенирован. Эукариотические белки-аргонавты были хорошо изучены, но затем выяснилось, что они есть и в прокариотах, где точно неясно ни их назначение, ни механизм работы. В исследовании 2014 года выдвигалось предположение, что их функция — защита от вирусов и мобильных элементов, и что помимо РНК-интерференции в прокариотах существует интерференция ДНК. Однако прямо этого показать не удалось, кроме того, все равно оставалось неясным, откуда аргонавты берут короткие ДНК-гиды.
Антон Кузьменко из Института молекулярной генетики РАН и его коллеги провели опыты in vivo с белками-аргонавтами прокариота Clostridium butyricum. Эти бактерии очень дорогие, живут в анаэробных условиях и работать с ними тяжело. Поэтому ученые при помощи плазмиды перенесли ген, ответственный за производство Argonaute, в клетки бактерий кишечной палочки (Escherichia coli). Попутно к гену была добавлена последовательность, кодирующая несколько остатков гистидина, поскольку петли из этой аминокислоты хорошо связываются с ионами металлов, что дает легкий способ извлечения белка из лизата бактерий.
После того как кишечная палочка размножилась, ее суспензию пропустили через гомогенизатор высокого давления, который гидравлически разрушает клетки бактерий, после чего Argonaute извлекли методом кобальтовой хроматографии. К извлеченным белкам добавили фенол-хлороформную смесь, которая их разрушила и высвободила гидовые молекулы.
Получив свободные молекулы ДНК, авторы отсеквенировали их по методу Illumina/Solexa и увидели, что в основном гиды происходят из одних и тех же мест генома, тех, где происходит терминация репликации (заканчивается удвоение ДНК). Это навело ученых на мысль, что отрезки молекул производятся системой гомологической рекомбинации-репарации (recBCD), которая действует в этой области генома и разрезает ДНК до тех пор, пока не увидит специальный стоп-сигнал хи-сайт (chi-site). Когда было обнаружено, что гидовые последовательности как раз ограничены хи-сайтами, гипотеза была подтверждена, и исследователи предположили, что recBCD и белки-аргонавты Clostridium butyricum действуют в связке и защищают клетку от вирусов и мобильных элементов. Поскольку хи-сайты есть только в своем геноме, система рекомбинации-репарации полностью разрушает чужеродный, а обрезки подхватывают белки-аргонавты и режут ДНК с такой же последовательностью, усиливая действие recBCD.
Чтобы экспериментально подтвердить защитные функции Argonaute, ученые вводили в кишечную палочку различные вирусы. Клетки, содержащие такие белки, выживали под действием вируса, а если и нет, то лизировались существенно дольше.
Воздействие вирусов на бактерии. Черные точки соответствуют мертвым бактериям; активные Argonaute есть только в нижнем образце
Кроме того, для прямой демонстрации ДНК-интерференции исследователи вводили в бактерию с белками-аргонавтами плазмиду с последовательностью, которая уже была в геноме бактерии. Через какое-то время фрагменты короткие ДНК из плазмиды связывались белком-аргонавтом в качестве гидов и направляли его к такому же месту в геноме, из-за чего там происходил разрыв.
У прокариотических Argonaute потенциально много применений в геномике. Например, с их помощь можно картировать места двуцепочечных разрывов генома. В местах таких разрывов действует recBCD, производя короткие куски ДНК. Самая заметная функция белков-аргонавтов — внесение разрывов в молекулы, но прежде чем их вносить, белок должен захватить гид, и эту связку, как было описано выше, могут легко извлечь ученые. Изучив отрезки, можно будет понять, где был изначальный разрыв. Существование ДНК-интерференции было прямо показано только сейчас.
Источник: N+1
