При помощи направленной эволюции ученые вывели рибозим, который способен синтезировать своего предка, — более короткую молекулу РНК, также обладающую каталитической активностью. Эта работа, опубликованная в журнале Proceedings of the National Academy of Sciences, приближает воссоздание самореплицирующихся РНК-систем, которые — если верить гипотезе РНК-мира — дали начало всей жизни на Земле.
РНК лигаза, каждая из трех цепей которой была синтезирована рибозимом-полимеразой
Весомым подтверждением гипотезы РНК-мира, постулирующей возникновение жизни из самовоспроизводящихся РНК-форм, можно было бы считать получение таких систем in vitro. За последние годы в этом направлении было сделано очень много, но вырастить при помощи направленной эволюции полностью самовоспроизводящуюся систему пока не получается. Для этого рибозим, синтезирующий РНК — РНК-полимераза — должен уметь аккуратно синтезировать как свою собственную последовательность, так и комплементарную для использования ее в качестве матрицы. Некоторые выращенные in vitro рибозимы уже умеют копировать себя частично или даже полностью, но эти реакции зависят от подборки субстратов-олигонуклеотидов, ограничивающих способность синтезируемой РНК к мутациям и эволюции.
Катрине Джунг и ее коллегам из Института Солка удалось вырастить РНК-полимеразу, которая способна синтезировать из мононуклеотидов хоть и не саму себя, но предковый рибозим. За основу была взята уже известная полимераза 24-3. Ее получили раньше из других рибозимов и она уже умела копировать небольшие последовательности РНК. Исследователи задались целью эволюционировать этот фермент так, чтобы она могла синтезировать сложные рибозимы, и в качестве промежуточной цели решили добиться синтеза рибозима-эндонуклеазы, способной разрезать РНК.
Для «обучения» полимеразы они использовали метод направленной эволюции. Слегка мутировавшие последовательности исходной полимеразы прикрепляли к поверхности при помощи праймера, а затем давали ей поработать. Если она справлялась с работой и синтезировала нормальную эндонуклеазу, та отрезала ее от поверхности, а если нет, то полимераза так и оставалась прикрепленной. Попавшие в раствор полимеразы исследователи размножали с добавлением новых мутаций и затем повторяли с ними цикл, но давая уже меньше времени на работу. Таким образом, на новый уровень отбирали только функциональные полимеразы, и с каждым циклом они все шустрее справлялись с заданной задачей. Всего ученые провели 38 циклов, но более-менее эффективные полимеразы появились уже на 14 раунде. В ходе эволюции исследователи получили три семейства рибозимов, из которых полимераза 38-6 оказалась наиболее эффективной. От исходной последовательности полимеразы 24-3 ее отличали 14 мутаций.
Схема работы готовой полимеразы. На первом этапе к ней пришивают праймер, прикрепленный к поверхности. Далее его последовательность достраивается по РНК образцу. Свежесинтезированная последовательность сворачивается в молоточкоподобную структуру, обладающую собственной ферментативной последовательностью и откусывает полимеразу. Джунг с соавторами., PNAS 2020
Удостоверившись в работоспособности полимеразы, авторы статьи задали ей задачу синтезировать другой рибозим, — лигазу I класса. Он был выбран не случайно. По сути, эта лигаза — простой предок самой полимеразы. У них общее каталитическое ядро, 77 процентов последовательности которого у них одинаковые.
Несмотря на успех с эндонуклеазой, в этом случае у рибозима 38-6 возникли проблемы с точностью. Лигаза состоит примерно из ста рибонуклеотидов, и для ее безошибочного синтеза требуется аккуратность не менее 99 процентов. Но полимеразе 38-6 лишь в 83 процентах случаев удавалось подставить правильный рибонуклеотид. Этого явно недостаточно для полноценного синтеза лигазы и тем более для синтеза самой полимеразы, длина которой в два раза больше.
Чтобы упростить задачу, исследователи разобрали лигазу на три отдельные последовательности, способные собираться в единую рабочую структуру. Такой комплекс слегка уступает в эффективности обычной лигазе, но синтезировать его без ошибок гораздо проще. Параллельный синтез трех цепочек оказался успешным, и, по словам ученых, это самый длинный и сложный рибозим, синтезированный из отдельных мононуклеотидов. Авторы статьи предполагают, что дальнейшие улучшения системы могут подтянуть точность рибозима до уровня, на котором будет возможна его нормальная саморепликация.
Интересно было бы проверить этот рибозим на сходство с современными РНК зависимыми РНК полимеразами вирусов, как известно они имеют высокое сходство между собой, то есть высоко консервативны. По-видимому, на протяжении длительной эволюции РНК зависимые РНК полимеразы обрели оптимальную форму ещё во времена РНК мира, то есть до появления ДНК.
Источник: N+1
