Давно известно, что значительную часть геномов эукариот составляют последовательности, которые не кодируют ничего полезного для клетки. Существенную долю из них составляют транспозоны, которые получили репутацию «эгоистичных элементов», — считается, что они паразитируют на аппарате транскрипции и репликации клеток, размножаясь, но не выполняя каких-либо функций. Благодаря последним исследованиям стало ясно, что эти элементы — важные участники адаптивной реакции клеток на стресс. Работа американских ученых проливает свет на новые детали пускового механизма этой реакции, включающего в себя саморасщепление SINE-элементов при участии вспомогательного белка EZH2.
Рис. 1. Графический синопсис, отражающий основные выводы обсуждаемого исследования. Вверху — модель того, как РНК SINE-элемента мыши B2 регулирует гены раннего ответа клетки на стресс. В состоянии покоя эти РНК препятствуют эффективному считыванию генов, присоединяясь к участкам ДНК внутри генов и создавая помеху для продвижения РНК полимеразы. Во время стрессового воздействия при участии белка-помощника EZH2 эти РНК самоуничтожаются, что приводит к активации транскрипции генов, запускающих дальнейший каскад реакций клетки по самоподдержанию и самовосстановлению. Внизу схематично показаны структуры РНК мышиных B2- и человеческих Alu-элементов с указанием позиций, по которым наблюдается их саморазрезание (красные крестики).
Геном человека, как и всех прочих млекопитающих, устроен весьма нерационально. Лишь менее 15% всей его длины (составляющей около 3 миллиардов пар нуклеотидов) несут признаки полезности — в этих участках можно выявить следы работы отбора по сохранению генетического «текста». Сюда входят, в основном, последовательности, кодирующие белки, а также различные регуляторные участки, с которыми связываются белки, участвующие в контроле считывания генетической информации. Остальная часть ДНК представляет так называемый «генетический мусор» (junk DNA), собранный разными путями и непонятно зачем снова и снова реплицирующийся вместе с полезной ДНК и передающийся от поколения к поколению на протяжении десятков и сотен миллионов лет.
На рис. 2 показано распределение ДНК человека по последовательностям разного типа. Видно, что примерно половину генома занимают транспозоны (их еще называют мобильными элементами). Главная особенность транспозонов — способность перемещаться и размножаться внутри генома. В этом процессе задействованы специальные ферменты, закодированные в самих транспозонах, а также некоторые «нормальные» клеточные ферменты. Предположительно, это и порождает раздувание бесполезной части генома: хотя отбор работает на сокращение количества «мусора» (часть ДНК может теряться благодаря делециям), но он снова и снова накапливается за счет размножения транспозонов, так что его количество остается примерно постоянным (прямо как дома на антресоли).
Рис. 2. Структура генома человека. Экзон — участок гена, несущий информацию о строении белка. CpG-островки — участки компактного расположения нуклеотидной пары цитозин-гуанин. Интрон — часть гена, не содержащая информации об аминокислотной последовательности. Сателлиты — очень длинные (в несколько сотен тысяч пар нуклеотидов) участки ДНК с тандемно («голова к хвосту») повторяющимися короткими блоками из 5−200 пар нуклеотидов. LTR-ретротранспозоны — мобильные ретроэлементы с длинными концевыми повторами (long terminal repeats). SINE — короткие перемежающиеся ретроэлементы (short interspersed nuclear elements). LINE — длинные перемежающиеся ретроэлементы (long interspersed nuclear elements).
Далее речь пойдет о недавних исследованиях, которые касаются только одной из нескольких групп транспозонов, — коротких мобильных SINE-элементов (от англ. short interspersed nuclear elements). У человека наиболее распространенные SINE-элементы именуются Alu, у мышей — B2. Именно этим элементам посвящены интересные результаты, полученные командой ученых из США под руководством Дженни Ли. Последняя их статья на эту тему вышла в недавнем выпуске журнала PNAS.
SINE-элементы имеют длину 200–300 пар нуклеотидов. В геноме как у мышей, так и у человека они занимают примерно по 10% всей ДНК, будучи представленными в количестве более 1 миллиона копий. У некоторой части SINE-элементов (речь идет о нескольких тысячах или десятках тысяч из миллиона) есть собственные рабочие промоторы, на которых может запускаться процесс транскрипции — считывания копий РНК. Однако обычно эти промоторы заблокированы, так что транскрипции не происходит, или почти не происходит. Скажем, в анализе РНК из клеток крови здорового человека количество синтезированных таким образом копий РНК Alu-элементов составит не более 100–1000 штук на клетку (сравните с числом копий самих элементов). Отметим, что считывание РНК на промоторах SINE-элементов обеспечивается РНК-полимеразой III — ферментом, который вообще специализируется на синтезе небольших молекул РНК (в том числе тРНК и 7SL РНК, от которых эволюционно и берут начало SINE-элементы).
Все те привычные гены, которые кодируют белки, считываются другим ферментом: РНК-полимеразой II. Это важный момент в нашем рассказе: именно этот фермент оказался важным звеном в регуляции клеточного ответа на стресс с участием SINE-элементов.
Напомним несколько имеющих отношение к делу фактов, которые были известны ранее:
1) У клеток имеется особый вид общей приспособительной реакции на стрессы различной природы (Cellular stress response). Стимулом для ее запуска может быть перегрев, недостаток питательных веществ или кислорода, воздействие токсичных веществ или мутагенов, агрессивного облучения, инфицирование вирусами и любые другие факторы, нарушающие нормальное функционирование клетки. Суть стрессовой реакции в том, что на время клетка перестает выполнять все те функции, которые не являются строго обязательными для выживания (тем самым экономя энергию), а все силы бросает на саморемонт и самоподдержание. Для этого необходимо одни гены отключить (все те, что не входят в число жизненно необходимых для клетки, — таких большинство), а другие, наоборот, активировать (к примеру, гены, отвечающие за ремонтные работы — в первую очередь, это гены шаперонов). Каков механизм переключения одновременно такого большого числа генов — понятно лишь отчасти (как и про механизм последующего возврата к обычному режиму работы). Одним из центральных дирижеров в этом процессе считается белок HSF1 (Heat Shock Factor 1). Он функционирует как активатор транскрипции генов. Однако было показано, что включение некоторых чувствительных к стрессу генов происходит и без его участия.
2) В 1990-е годы было обнаружено значительное (в десятки раз) повышение количества РНК SINE-элементов на фоне клеточного стресса (например, статьи 1993 и 1995 г.) Как известно, само по себе наличие корреляции между событиями не позволяет понять отношения причины и следствия. Повышение количества РНК SINE-элементов может быть следствием неспособности стрессированной клетки достаточно эффективно осуществлять надзор за этими «эгоистичными» элементами генома, это выглядит вполне правдоподобным объяснением. Но не может ли активация SINE-элементов составлять необходимую часть самого механизма стрессового ответа?
3) В работах американской группы ученых под руководством Джеймса Гудрича, проводившихся в 2004–2009 годах было установлено, что транскрипты SINE-элементов мыши и человека способны непосредственно взаимодействовать с РНК-полимеразой II (той самой, что нужна для транскрипции генов, кодирующих белки), и препятствовать ее нормальной работе. РНК-полимераза, связанная с SINE, присоединяется к своим промоторам, но при этом не может начать синтезировать РНК. Тогда повышение транскрипции SINE-элементов может рассматриваться как адаптивный механизм в реализации стрессового ответа — может быть именно эти РНК и ответственны за общее подавление активности транскрипции белок-кодирующих генов в клетке? Интересно, что промоторы генов шаперонов, и других генов, активирующихся при стрессе, оказываются каким-то образом защищены от блокирующего влияния РНК SINE-элементов и их транскрипция происходит беспрепятственно. Возможно, какие-то из кофакторов, присутствующих на промоторах этих генов, помогают РНК-полимеразе освободиться от этих РНК? Схема описанного механизма показана на рис. 3.
Рис. 3. (a) — считывание разных типов SINE-элементов при участии РНК-полимеразы III. У мышей это элементы B1 и B2, у человека — Alu-элементы. (b) — из-за связывания элементов B2 или Alu (но не B1) с РНК-полимеразой II блокируется инициация транскрипции на промоторах большинства генов, кодирующих белки. (c) — на промоторах генов шаперонов (HSP), как и некоторых других генов стрессового ответа, РНК-полимераза II работает беспрепятственно, поскольку с ней здесь не связывается РНК SINE-элементов.
Теперь можно перейти к обсуждению работ группы Дженни Ли, благодаря которым стали известны новые любопытные детали, касающиеся участия SINE-элементов в клеточном ответе на стресс.
Сначала расскажем о работе 2016 года. Авторы проводили эксперименты на мышиной клеточной культуре. Клетки подвергались тепловому шоку — 15-минутному нагреву до 45°С. До начала шока и по истечении 15 минут клетки собирали для разнообразных анализов.
Выяснилось, что РНК-продукты SINE-элементов могут связываться с определенными участками хромосом. Из всех выявленных сайтов связывания 3/4 попали в межгенные области (это участки, где, по нашим сведениям, нет ничего интересного), но еще примерно 1/4 сайтов связывания попадали в область кодирующих генов, в основном — в интроны. Откровенно говоря, полученное распределение само по себе очень похоже на случайное — примерно так (3:1) и соотносится общее количество межгенной и внутригенной ДНК. Но в качестве контраргумента авторы обращают внимание на то, что, во-первых, основная часть внутригенных сайтов связывания попадала в первый интрон генов, а во-вторых, во многих генах таких сайтов связывания оказывалось сразу несколько, при том, что в большинстве других генов их нет вовсе.
Далее, было показано, что в общем комплекте мест связывания РНК SINE-элементов в ДНК можно выделить набор участков, обнаруживаемых только до теплового шока (первая группа, в сумме 13 368 сайтов) и набор участков, обнаруживаемых только через 15 минут теплового шока (вторая группа, всего 25 634 сайта). Лишь 5734 сайта (третья группа) присутствовали как до, так и после теплового шока. Замечательно то, что присутствие этих сайтов хорошо коррелировало с динамикой изменений активности генов: 151 ген, в которых присутствовали сайты первой группы, считывались редко до теплового шока, но повышали экспрессию после 15-минутного перегрева. В то же время 218 генов, в которых присутствовали сайты второй группы, наоборот, активно работали в клетках без стрессового воздействия и подавлялись после теплового шока.
Таким образом, в общей сложности здесь наблюдается стресс-зависимая регуляция относительно небольшой группы генов — их всего 369, но это те гены, которые отвечают на стресс очень быстро, в течение первых 15 минут — такие гены называют генами раннего ответа. Ранее было показано, что в течение первого часа в клетках млекопитающих происходит активация считывания около 1500 и подавление 8000 генов. Между прочим, среди этих 369 генов не оказалось генов шаперонов.
Исследуя механизм, авторы выяснили, что РНК SINE-элементов, связываясь с ДНК внутри генов на некотором расстоянии от точки начала транскрипции (в основном, в пределах нескольких тысяч нуклеотидов), могут подавлять транскрипцию на этапе элонгации. То есть РНК-полимераза начинает синтезировать РНК, но натыкается на препятствие в виде присоединенной РНК SINE-элемента (авторы сравнивают ее с лежачим полицейским), которое тормозит ее продвижение дальше вдоль гена (схематично это показано на рис. 1).
Еще одним важным и неожиданным участником механизма оказался белок EZH2. Этот белок достаточно давно известен тем, что в составе большого репрессорного белкового комплекса PRC2 (Белки группы polycomb) он присоединяет метильные группы к остатку лизина в гистоне H3 на промоторах генов (устанавливая метки H3K27me3), и тем самым участвует в подавлении их транскрипции.
Авторы обсуждаемого исследования заметили, что после теплового шока этот белок появляется в тех самых местах, где располагаются сайты связывания РНК SINE-элементов первой группы. Таким образом, получается, что до теплового шока здесь находятся РНК SINE-элемента, после теплового шока в эти участки прибывает EZH2 (и одновременно исчезает РНК SINE-элемента), а в итоге происходит активация генов, внутри которых все это происходит. Кажется, это должно быть неспроста. Интересно, что EZH2 появляется в указанных участках без сопровождения других белков комплекса PRC2. А между тем известно, что метилировать гистоны он способен только в составе этого комплекса. И действительно, метилирования гистонов в области связывания РНК SINE-элементов при появлении EZH2 не наблюдается. Что же тогда тут происходит?
Другой неожиданный факт, установленный учеными, заключается в том, что EZH2 оказался способным эффективно связывать РНК SINE-элементов и стимулировать их расщепление на два или три фрагмента. Собственно, в последней работе, опубликованной в декабре 2019 года в журнале PNAS, авторы уточняют, что фрагментация РНК SINE-элементов (мышиных B2 и человеческих Alu) может происходить самопроизвольно за счет каталитической (рибозимной) активности этих РНК. Иначе говоря, они могут разрезать себя сами. Но для того, чтобы разрезание произошло, молекулы должны перейти в активную пространственную конформацию. Сами по себе они в эту конформацию переходят с трудом, а вот связывание с EZH2 этот переход существенно облегчает, и в итоге эффективность саморазрезания молекул РНК повышается в сотни раз.
Итак, авторы предлагают следующую модель запуска стрессовой реакции: небольшое количество РНК SINE-элементов, присутствующих в клетке при ее нормальном физиологическом состоянии, сидит внутри ранних генов стрессового ответа и мешают их считыванию РНК-полимеразой. При появлении сигнала стресса к местам локализации РНК SINE-элементов прибывает белок EZH2, инициирует их самоустранение, и это немедленно приводит к считыванию соответствующих генов. В результате нарабатываются белки, смысл которых в том, чтобы обеспечить включение и выключение всех прочих (поздних) генов стрессового ответа.
Доказать, что присутствие РНК SINE-элементов и участие белка EZH2 являются именно причинными факторами в регуляции активности генов стрессового ответа позволили эксперименты с искусственным блокированием данных молекул при помощи РНК-интерференции. Для отключения SINE-элементов использовали смесь антисмысловых олигонуклеотидов подобранных так, чтобы они могли срабатывать на большинстве вариантов последовательностей этих элементов (они, надо отметить, весьма разнообразны). В этом эксперименте ученые ожидали увидеть активацию генов раннего стрессового ответа даже в отсутствие стрессового воздействия на клетки — и именно это действительно наблюдалось.
Для отключения влияния EZH2 также использовали антисмысловые олигонуклеотиды, в результате чего содержание белка в клетках было сильно снижено. Как и ожидалось, исходя из предложенного механизма, это приводило к тому, что гены, которые в норме быстро активируются в ответ на стрессовое воздействие теперь оставались неактивными и стрессовая реакция не развивалась по своему обычному сценарию.
Таким образом, эти исследования позволили установить следующие новые факты:
1) РНК SINE-элементов могут блокировать транскрипцию не только на уровне инициации, связываясь с РНК полимеразой II, но и на уровне элонгации, связываясь с ДНК внутри генов за точкой инициации транскрипции. Правда, пока это было показано только на мышиных B2-элементах. Для человеческих Alu-элементов соответствующие анализы пока не проводились.
2) По крайней мере некоторые РНК SINE-элементов являются рибозимами, обладая способностью катализировать саморазрезание.
3) Белок EZH2 может работать как подавитель транскрипции, работая в составе репрессорного комплекса и метилируя гистоны в промоторах генов, но может действовать и в противоположном направлении, активируя гены за счет содействия самоустранению РНК SINE-элементов, подавляющих транскрипцию на этапе элонгации.
Отметим и вопросы, которые все еще маячат на горизонте. Во-первых, совершенно неизвестно, каков механизм стимулирования транскрипции самих SINE-элементов при инициации стресса. Во-вторых, непонятно, что заставляет белок EZH2 прибывать к местам локализации РНК SINE-элементов при инициации стресса. В-третьих, неясно, каким образом те гены, которые должны быть активными во время стрессового ответа, защищены от ингибирующего влияния РНК SINE-элементов. В-четвертых, было бы интересно узнать, что происходит со всеми этими РНК SINE-элементов по завершении стрессовой реакции и как клетка возвращается в нормальный режим работы. Задействован ли, к примеру, и на этом этапе белок EZH2? Или может быть, избыток этих РНК устраняется при участии каких-то иных механизмов? Полагаю, над этими вопросами кто-то уже активно работает и вскоре мы узнаем еще больше любопытных и важных деталей о клеточном стрессе.
Источник: ЭЛЕМЕНТЫ БОЛЬШОЙ НАУКИ
