Недуг, прозванный чумой XXI века. В наши дни рак является одним из самых страшных заболеваний. В 2010 году более семи миллионов людей по всему свету умерли от рака. В Соединенных Штатах каждая третья женщина и каждый второй мужчина рано или поздно заболеют раком. По прогнозам ВОЗ, число случаев заболевания будет продолжать расти от 14 миллионов в 2012 году до 22 миллионов в следующие десятилетия. Пугающие числа, от которых невольно бросает в дрожь. Однако процесс ракового перерождения, или малигнизации, не только страшен, но и интересен, и в этой статье мы разберемся, почему же некоторые «избранные» клетки решают свернуть не туда и как это влияет на самого «изменника».

Под малигнизацией понимают приобретение здоровыми клетками черт злокачественности, которые мы подробно рассмотрим ниже. Процесс злокачественного изменения можно уподобить дичи из цитаты Кафки, ведь клетка, однажды встав на этот путь, не сможет вернуться и получить свое клеточное здоровье обратно. Важную роль в понимании основ перерождения клеток и их дальнейшего функционирования сыграла медицина, а следом за ней и молекулярная биология. Но начнем с истоков истории рака...

Часть 1. Биография рака

Первые упоминания о раке встречаются в папирусе Эдвина Смита, датируемом 16 веком до нашей эры. Там же отмечается, что данное заболевание не поддается лечению.

Во времена Гиппократа, около 400 года до нашей эры, появилось специальное обозначение рака — karkinos. Разросшаяся опухоль напомнила Гиппократу краба, окутывающего все вокруг клешнями. Современное название онкологии произошло от греческого слова onkos, которое греки использовали для описания опухолей. Однако врачи того времени не различали доброкачественные и злокачественные новообразования, и karkinos Гиппократа не имеет ничего общего с истинным раком.

Гиппократ выдвинул гуморальную теорию, суть которой состояла в том, что каждый недуг является следствием переизбытка одного из четырех гуморов: крови, слизи, желтой желчи и черной желчи.

Гален, греческий врач, практиковавший в Риме около 160 года нашей эры, довел теорию Гиппократа до совершенства. Он заявил, что рак образуется из-за переизбытка черной желчи. Гален умер в 199 году нашей эры, но его «черная желчь» еще долго будоражила умы онкологов.

Только спустя пять столетий, в 1538 году, Андреас Везалий опроверг теорию Галена, делая вскрытия в Парижском университете. Окончательно похоронил галенову теорию лондонский анатом Мэтью Бейли, который в 1793 году опубликовал учебник «Патологическая анатомия некоторых наиболее важных частей человеческого тела», в котором представил рисунки и описания раковых опухолей, где не было и следа «черной желчи».

Изобретение микроскопа повлекло за собой первые цитологические исследования рака. В 1801 году французский физиолог Франсуа Биша и в 1838 году Иоганн Мюллер определили, что опухоли имеют клеточную структуру. После этого Жан Крювелье высказал гипотезу «канцероматозной дегенерации», основанную на предположении, что клетка проходит несколько этапов, прежде чем окончательно превратиться в раковую. Немецкий хирург Карл Тирш доказал, что раковая опухоль происходит из эпителиальной ткани, а саркома — из соединительной.

Первая половина XX века породила еще одну теорию канцерогенеза, недалеко ушедшую от истины. В 1911 году Пейтон Раус, работая в Рокфеллеровском университете в Нью-Йорке, открыл вирус, способный вызывать опухоли у кур. Ученые по всему свету бросились искать вирусы, ответственные за рак именно у человека, однако ничего не могли найти. В 1974 году в Medical World News вирус рака у человека ставили в один ряд с НЛО, снежным человеком и лохнесским чудовищем. Вирус СВ-40 и вирус папилломы человека, вызывающие рак у людей, были открыты в 1960 и 1983 годах соответственно.

В 1970 году генетик Говард Темин, работавший в лаборатории Макардла в Висконсине и изучавший вирус саркомы Рауса (ВСР, или VSR), представил свою работу на Десятом Международном онкологическом конгрессе. Он открыл у ВСР обратную транскрипцию — синтез ДНК по РНК — и положил начало изучениям ретровирусов. Позднее он отказался от вирусной теории канцерогенеза, а в 1979 году ученые Майкл Бишоп и Харолд Вармус открыли первый протоонкоген — src (сарк), содержащийся в ВСР. Это положило начало новому этапу в истории онкологии, люди наконец-то поняли, как запускается процесс канцерогенеза. Но этого бы не произошло без изучения раковой клетки и ее странной физиологии.

Часть 2. Что заставляет клетку измениться?

В этой главе мы разберем причины злокачественного перерождения клетки. Первым толчком к началу этого изменения является мутация в ДНК.

Важными факторами, вызывающими мутации и провоцирующими раковое перерождение, являются ионизирующее излучение, воздействие ультрафиолетовых лучей, влияние цитотоксических веществ, повреждающих ДНК (к ним относятся наркотические вещества и некоторые лекарственные препараты — например, цисплатин, повреждающий структуру двойной спирали) и органические яды.

Но не всякие повреждения ДНК обязательно приведут к появлению раковой клетки, а лишь те, что затронут определенные гены. Наиболее важную роль в канцерогенезе играют три группы генов: протоонкогены, онкогены и гены — супрессоры опухолей.

Протоонкогены

Протоонкогены — это «здоровые» предшественники онкогенов, которые в результате мутации могут вызвать развитие опухоли. Такими причинами являются различные мутации или суперэкспрессия гена. Как правило, протоонкогены кодируют белки, участвующие в процессах жизненного цикла клетки. В результате мутаций появляются сбои в регуляции клеточного деления и дифференцировки.

Основные изменения, происходящие с протоонкогенами:

Транслокация — перенос генетического материала с одной хромосомы на другую. Часто в результате такой перестройки появляется новый химерный ген, имеющий канцерогенные свойства. Характерным примером химерного онкогена служит BCR-ABL, появляющийся в «филадельфийской хромосоме» (рис. 1) — результате реципрокной транслокации между участками 9 и 22 хромосом.

Эта мутация приводит к развитию хронического миелоидного лейкоза, который сегодня успешно лечится. Также в 90–95% случаев саркомы Юинга — злокачественной опухоли костной ткани, поражающей в основном трубчатые кости, — обнаруживают транслокацию между 11 и 22 хромосомами, которая приводит к образованию гена, кодирующего патологический белок EWS/FLI1.

Рисунок 1. Химерный ген BCR-ABL образуется при слиянии участка 9 хромосомы, несущей ген ABL, с участком 22 хромосомы, несущей ген BCR

Амплификация — увеличение числа копий участка ДНК. Амплификация часто является механизмом активации онкогенов. Например, амплификация и, как следствие, суперэкспрессия гена белка N-Myc приводят к развитию нейробластомы агрессивного типа.

Делеция — мутация, при которой происходит потеря участка хромосомы. Делеция 13q-Rb (делеция участка большого плеча 13 хромосомы, содержащего ген RB) приводит к развитию ретинобластомы (злокачественной опухоли глаза) у детей.

Замена одного нуклеотида на другой. Мутация BRAF V600 при меланоме заменяет валин на глутаминовую кислоту в ферменте BRAF.

Инсерция — генетическое изменение, при котором в ДНК вставляется новая последовательность. Например, инсерции Alu-элементов — коротких повторов в ДНК, не кодирующих никаких белков, — являются причиной таких форм рака, как рак молочной железы и саркома Юинга.

В некоторых случаях канцерогенез запускается вирусами. Онкогены в геноме вирусов являются ранее захваченными в клетках-хозяевах нормальными генами, которые со временем превратились в злокачественные. Когда такие онкогенные вирусы попадают в клетку, начинается считывание информации с вирусной ДНК или РНК, в цитоплазме накапливаются онкогенные белки и начинается процесс перерождения.

Онкогены

Онкогены — это гены, активность которых стимулирует образование и развитие злокачественной опухоли. Как уже было упомянуто выше, первый вирусный онкоген был открыт в 1979 году.

Биохимические продукты онкогенов

Онкогены кодируют белки с различной структурой и функциями. К основным продуктам деятельности онкогенов относят:

Факторы роста. Раковые клетки продуцируют белки, способные вызывать пролиферацию и дифференцировку клеток. Наиболее известным фактором роста является HER2, кодируемый геном ERBB2. Мутации и гиперэкспрессия этого гена обнаружены при раке молочной железы и ассоциированы с крайней агрессивностью опухоли. Суперэкспрессия гена приводит к запуску белковых каскадов, ответственных за клеточное деление. Постоянные сигналы к делению вызывают неконтролируемую пролиферативную активность клеток и их злокачественное перерождение.

ГТФ-связывающие белки. Гуанозинтрифосфат-связывающие белки участвуют во многих клеточных процессах: передача сигналов, транспорт метаболитов внутри клетки и др. Первыми открытыми ГТФ-связывающими белками были белки семейства Ras — продукты онкогена RAS. При постоянном производстве они вызывают злокачественный рост. Наиболее изученный эффектор Ras — это RAF, который запускает белковый каскад MAPK, отвечающий за клеточное деление и пролиферацию.

Мембранные рецепторы. В онкогенезе основную роль играют рецепторы с тирозинкиназной активностью. Они служат для связывания с ростовыми факторами. К ним относится рецептор эпидермального фактора роста, повышенный синтез которого приводит к перерождению клетки.

Онкогенные протеинкиназы. Протеинкиназы — это группа ферментов, которые модифицируют белки путем фосфорилирования (присоединения остатка фосфорной кислоты). Протеинкиназы регулируют апоптоз, процессы роста и дифференцировки клеток. Нарушения в их работе приводят к сбою в клеточном цикле и, как следствие, к развитию рака. Например, протеинкиназа AKT1, ответственная за ингибирование апоптоза, при перепроизводстве способна вызывать перерождение клеток. Также, она связана с ростом сосудов в опухоли, что помогает раковым клеткам расселяться по организму и давать метастазы.

Все вышеперечисленные продукты онкогенов являются сигналами к запуску неконтролируемого клеточного деления. Внешние факторы больше не играют никакой роли в жизни клетки, потому что пролиферацию запускают внутренние сигнальные белки.

Гены и белки — супрессоры

В здоровой клетке существуют защитные механизмы, следящие за процессами и регулирующие клеточный цикл. К таким механизмам относят деятельность белков — супрессоров опухолей: p21, p53, pRb, PTEN и др.

Белок p53 — наиболее изученный белок-супрессор. Он является продуктом гена TP53, мутации которого обнаруживаются в клетках многих опухолей. p53 синтезируется во всех клетках организма, но активируется только при повреждениях ДНК. Этот белок способен остановить клеточный цикл и не допускать дальнейшее деление клетки, пока не произойдет репарация ДНК. При сильных повреждениях он также может запускать процесс апоптоза.

Одной из главных функций p53 является сохранение генетической идентичности всех клеток организма. При неправильной работе этого белка клетка получает возможность делиться даже при поврежденной ДНК, что увеличивает вероятность мутаций и накопления дефектных онкогенов. Важную роль в подавлении p53 играет белок MDM2, который в норме регулирует активность p53. Однако при повышенном синтезе он связывается с p53 и ингибирует его противоопухолевое действие.

Эпигенетические факторы рака

Важными факторами канцерогенеза являются эпигенетические события. Эпигенетика изучает процессы, затрагивающие активность генов, но не изменяющие структуру ДНК. К ним относится изменение метилирования ДНК.

Метилирование — это присоединение метильной группы к нуклеотидам в особых, строго определенных участках генома, называемых CpG-островками. Такое изменение не влияет на структуру молекулы, однако может влиять на экспрессию отдельных генов. В частности, если в участке ДНК много метильных групп, то транскрипция этого участка прекращается.

Особенно активно метилирование проходит в эмбриональный период жизни, а у взрослого человека метилировано около 2% генома. В норме баланс между метилированием и деметилированием строго регулируется и соблюдается, однако в старости начинают преобладать процессы метилирования, что может в итоге привести к канцерогенезу. В процессе онкогенеза происходит гиперметилирование CpG-островков, что приводит к общей геномной нестабильности и накоплению еще большего количества мутаций. В большинстве случаев метилированные участки являются промоторами и влияют на активацию или, наоборот, инактивацию генов, что с виду похоже на действие точечных мутаций.

Однако хотя нарушения в эпигенетической регуляции сопровождают развитие злокачественного перерождения, они, как правило, не являются его первопричиной, а лишь одним из сопутствующих факторов.

По отдельности каждое из вышеперечисленных нарушений не может спровоцировать раковое перерождение. Все они работают совместно и слаженно. Так, онкогенез запускается, только если одновременно активированы онкогены и инактивированы гены-супрессоры в обеих копиях ДНК. Впервые теорию двойного канцерогенеза высказал Альфред Кнудсон, изучавший ретинобластому: «По всей видимости, — писал он, — в возникновении рака у детей ключевую роль играют два типа генов. Первый, онкогены, действует посредством повышенной, аномальной активности... Второй же класс, антионкогены, в онкогенезе рецессивен: рак происходит лишь тогда, когда обе нормальные копии удалены или изменены». В процессе жизнедеятельности раковая клетка накапливает все большее количество мутаций, поэтому раковый геном часто очень сильно отличается от генома здоровой клетки (рис. 2).

Рисунок 2. Хромосомы. В процессе жизнедеятельности раковая клетка накапливает огромное количество мутаций и нередко характиризуется полиплоидностью.

Часть 3. Физиологические последствия малигнизации

Основное последствие малигнизации — клеточное бессмертие. Оно может поддерживаться несколькими способами: активацией фермента теломеразы, блокировкой регуляторов митохондриального пути апоптоза и в некоторых случаях активацией механизма ALT (alternative lengthening of telomeres, альтернативного удлинения теломер).

Обратная сторона «вечной молодости»

Впервые клеточное бессмертие раковых клеток было продемонстрировано в 1951 году на клеточной линии HeLa, взятой у Генриетты Лакс, вскоре скончавшейся от рака шейки матки (рис. 3).

Рисунок 3. Клеточная линия HeLa — «бессмертная» линия раковых клеток. С 50-х годов прошлого столетия используется для изучения поведения раковых клеток и выявления новых противораковых препаратов.

Как правило, малигнизация сопровождается активацией фермента теломеразы. На концах хромосом находятся короткие повторяющиеся участки ДНК, названные теломерами. После каждого деления теломеры укорачиваются, что в итоге приводит к их полному исчезновению и невозможности продолжать деление. Количество возможных делений для клетки названо пределом Хейфлика. Действие теломеразы заключается в восстановлении теломер и превращении клетки в фактически бессмертную, позволяя ей делиться бесконечно долго. Существуют нормальные клетки, в которых также экспрессируется теломераза. Это клетки, которым надо часто делиться: половые, стволовые и клетки эпителия кишечника. Однако теломераза активна в подавляющем большинстве раковых клеток, что играет важную роль в их жизненном цикле.

С другой стороны, в некоторых злокачественных клетках, наравне с активной теломеразой, существует так называемое альтернативное удлинение теломер, или сокращенно ALT. При ALT происходит гомологичная рекомбинация концевых участков хромосом (рис. 4). В норме рекомбинация происходит в процессе мейоза, однако раковые клетки научились достраивать теломеры, используя теломеры другой хромосомы как матрицу.

Рисунок 4. Принцип действия ALT, основанный на гомологичном достраивании концов теломер. Такой механизм «бессмертия» является основным для ряда опухолей.

Важно отметить, что раковое бессмертие контролируется не только теломерами, но и ингибированием путей апоптоза, главным из которых является митохондриальный путь. В норме, из митохондрий в цитоплазму выходят митохондриальные белки и образуют апоптотический комплекс — апоптосому, которая и запускает апоптоз. При неправильной работе регуляторных белков, а к ним относятся белки семейства BCL-2, нарушается выход апоптотических белков, что приводит к сбою в процессе апоптоза. В раковых клетках обнаружены нарушения в работе белков BAX и BAK, а также экспрессия ингибиторов клеточной смерти.

Часть 5. Парадокс существования человеческого организма и иммунитет.

Принимая, что суммарная ДНК гаплоидного генома человека насчитывает ~3·10⁹ п.о., а частота спонтанных мутаций в среднем составляет 10^-8 на нуклеотид за генерацию, можно предположить, что, начиная с первого деления оплодотворенной яйцеклетки в процессе онтогенетического развития организма человека, каждое следующее деление должно сопровождаться появлением в их геномной ДНК, по крайней мере, 30 независимых мутаций. Организм человека состоит из ~10¹⁵ клеток. Для образования стольких клеток из оплодотворенной яйцеклетки требуется ~50 клеточных генераций. Следовательно, гаплоидный геном каждой из соматических клеток человека 50-й генерации должен содержать в разных частях, по крайней мере, 1500 мутаций. Если предположить далее, что набор из 30 мутаций возникает и закрепляется в каждом последующем клеточном делении независимо от мутаций, полученных во время предыдущих делений клеток, то получается, что любая дочерняя соматическая клетка наследует от клетки-предшественницы все имеющиеся в ее геноме мутации и приобретает блок новых 30 мутаций. При этом набор соматических мутаций в потомстве каждой из делящихся клеток одного поколения будет отличаться один от другого, в том числе и в парах аллельных локусов ДНК отдельных клеток, поскольку они редуплицируются независимо. При таком развитии событий мутации, возникающие в геноме соматических клеток каждой последующей генерации, случайным образом сканируют шаг за шагом всю реплицирующуюся геномную ДНК, а результаты сканирования не повторяются в каждом новом поколении клеток. Так, блок из 30 спонтанных мутаций, возникающих после гипотетической 50-й генерации соматических клеток в онтогенезе многоклеточного организма, должен присутствовать в ~10¹⁵ (2⁵⁰) вариантах.

Проблема становится еще более очевидной, если иметь в виду, что многие клетки организма, например, эпителиальные или стволовые клетки крови, пролиферируют на протяжении всей жизни многоклеточного организма, совершая громадное число клеточных делений. По некоторым оценкам, общее число клеточных циклов, в которых участвуют клетки человека на протяжении его жизни, приближается к 10¹⁶. Кроме того, соматические мутации возникают в многоклеточном организме не только в активно пролиферирующих, но и покоящихся клетках. Частоты возникновения спонтанных мутаций в пролиферирующих и в покоящихся клетках млекопитающих в ряде случаев различаются лишь незначительно.

Парадоксальность эволюционно сложившейся генетической ситуации заключается в том, что, если бы большая часть последовательностей нуклеотидов геномной ДНК заключала в себе жизненно важную генетическую информацию, существование многоклеточных организмов было бы невозможно. Их гибель происходила бы из-за неизбежного накопления в делящихся соматических клетках вредных или летальных мутаций, приводящих к обрыву линий дифференцирующихся в онтогенезе соматических клеток. Это особенно относится к мутациям в жизненно важных генах половых хромосом, которые в соматических клетках находятся в гемизиготном состоянии. Альтернативно основные генетические локусы многоклеточных организмов могут находиться под дополнительной защитой от мутационных изменений.

Показано что Т-клетки здоровых людей распознают до 20% неоантигенов (мутантных белков), а Т-клетки больных раком доноров распознают чуть более 1 % неоантигенов. Таким образом ежедневно в организме здоровых людей образуется несколько десятков раковых клеток. Но здоровый иммунитет их уничтожает.

Недавно, авторы статьи в Science Translational Medicine продемонстрировали, что вакцины на основе ослабленного вируса имеют противораковую активность — как настоящие онколитические вирусы. Введение вакцины мышам активирует транскрипционный фактор NF-κB, контролирующий гены иммунного ответа и в комбинации с иммунотерапией позволяет добиться стопроцентной выживаемости.

Непосредственную противораковую активность самых многообещающих ротавирусных вакцин авторы статьи проверили на мышиной модели нейробластомы, устойчивой к иммунотерапии ингибиторами CTLA-4, PD-1 и PD-L1. Они продемонстрировали, что инъекция ротавируса в целом тормозит развитие опухоли и отсрочивает гибель мышей. Более того, в одном из вариантов эксперимента четыре мыши из десяти выздоровели. Еще более обнадеживающий результат показала комбинированая терапия ингибиторами CTLA-4 и ротавирусной вакциной: в этом случае все 20 экспериментальных мышей выздоровели, тогда как контрольные мыши погибли к тридцатому дню исследований. В случае для нескольких опухолей достигался аналогичный эффект, несмотря на то, что вакцину кололи только в одну из них. Так что победа над раком возможна не за горами.

Источник: БИОМОЛЕКУЛА