Книга рассказывает, как вирусы стимулируют эволюционные изменения в организме их хозяев, формируют глобальные экосистемы и влияют на каждую область жизни.

Майкл Кордингли - изучал естествознание в Кембриджском университете, в 1983 году получил степень PhD по вирусологии в Университете Глазго. Работал в Национальном институте онкологии (США), на отделении биохимии Университета Макгилла (Канада), но в основном его карьера связана с фармацевтической индустрией. Основатель канадской компании Revolution Pharma Consulting, научный консультант Antiva Biosciences, компании из Сан-Франциско, которая разрабатывает препараты для борьбы с заболеваниями, вызванными папилломавирусами человека.

Глава 8. Вироиды и мегавирусы: крайности

Выше я писал, что лучше всего понять идентичность и эволюцию вируса можно, если считать вирусы независимо развивающейся, эгоистичной и передающейся из клетки в клетку генетической информацией. Первым примером стал вирус табачной мозаики, маленький растительный вирус. Позже я обратил ваше внимание на простоту РНК-содержащего бактериофага Qβ с его крошечным одноцепочечным геномом, способным кодировать всего четыре гена. На другом краю спектра мы наблюдали вирусы герпеса и поксвирусы — крупные вирусы, содержащие двухцепочечную ДНК. Они инфицируют и поражают заболеваниями позвоночных и беспозвоночных, и некоторые из этих вирусов экспрессируют сотни генных продуктов, призванных наилучшим образом адаптировать способ существования вирусов к особенностям клеток-хозяев. Все они соответствуют критериям, постулированным первыми вирусологами: они представляют собой фильтрующиеся через фарфоровые фильтры и передающиеся из клетки в клетку инфекционные агенты, состоящие из нуклеиновой кислоты, заключенной в белковую оболочку, то есть обладают свойствами, соответствующими их физическим характеристикам и их способности передаваться от хозяина к хозяину, будь это отдельные клетки или многоклеточные организмы, состоящие из огромных клеточных конгломератов. Передача — главный отличительный признак любого вируса. Хотя мобильные генетические элементы описываются как эгоистичная ДНК, эти элементы, определенно, не являются инфекционными агентами. По этой причине я пока не стал их описывать (см. главу 14, где мы обсудим эндогенные ретровирусы). Однако есть и другие классы агентов, которые невозможно обойти вниманием. В этой главе мы обсудим самые мелкие и самые крупные вирусы. Они соответствуют критериям, позволяющим включить их в наше обсуждение, но делают это несколько иным способом; они выпадают за границы приведенного простого определения вирусов, и для понимания их особенностей нам придется напрячь наше воображение.

Вироиды: мельчайшие из мелких

В 1967 году Динер и Реймер, ученые, работавшие в Исследовательском центре Министерства сельского хозяйства США в Белтсвилле (штат Мэриленд), опубликовали статью, озаглавленную: «Веретенообразный вирус картофельного клубня: вирус растения со свойствами свободной нуклеиновой кислоты». Через семьдесят лет после того, как был описан первый вирус, у вирусологов появилось новое поле для исследования. За эти семьдесят лет во многих исследованиях вирусы были в достаточной степени охарактеризованы как важная причина заболеваний у людей, а также у экономически важных животных и растений. Все эти вирусы состоят из нуклеиновых кислот, упакованных в капсид, иногда одетый в липидную оболочку. Вирус веретеновидности картофельных клубней поражает рост стебля и листьев картофеля, а в 1923 году было показано, что это заболевание вызывается фильтрующимся инфекционным агентом — вирусом. Патологические эффекты вируса веретеновидности картофельных клубней часто варьируют, и их трудно выявить, но после того, как был подобран подходящий суррогатный хозяин, начались серьезные исследования вируса веретеновидности картофельных клубней. За пять лет до этого Реймер открыл, что этот вирус может расти на томатах; еще важнее было то, что он вызывал отчетливые и воспроизводимые признаки заболевания. Теперь в распоряжении исследователей было индикаторное растение, которое позволяло количественно оценивать заразительность препаратов вируса. Теперь появилась возможность биохимического выделения и характеристики вируса. В 1967 году вышла одна из статей в серии работ, в которых была выяснена истинная природа инфекционного агента вируса веретеновидности картофельных клубней. Ученые использовали разнообразные физические и биохимические методы для определения природы инфекционных частиц, выделенных из листьев пораженного картофеля. Результаты исследований оказались беспрецедентными; инфицирующая способность для растений томата ассоциировалась с частицами, которые при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы оказались намного менее плотными, чем все другие, исследованные до тех пор вирусы. Более того, инфицирующая способность препаратов оказалась резистентной к воздействию фенола (вещества, используемого для денатурации и экстракции белков из вирусных частиц), а при обработке нуклеазами была устойчива в отношении дезоксирибонуклеазы и поддавалась действию рибонуклеазы только при низкой концентрации солей. Ученые были осторожны в своих выводах: «Независимо от химической природы вируса веретеновидности картофельных клубней, наш опыт демонстрирует, что он является весьма необычным патогеном. Если учесть нуклеиново-кислотные свойства вируса веретеновидности картофельных клубней, легкость, с какой он передается, его удивительная устойчивость и высокоспецифичная инфекционность просто поражают» (Diener, Raymer, 1967). Еще более любопытным оказался тот факт, что высокотоксичные экстракты практически не поглощали свет в ультрафиолетовом спектре. Вирус было невозможно выявить с помощью той самой методики, которую применяют для обнаружения и количественного определения нуклеиновых кислот. Более того, экстракты можно было разводить в миллион раз, но они, несмотря на это, продолжали заражать растения томата. Если инфекционным агентом действительно была нуклеиновая кислота, то она присутствовала в экстракте в ничтожно малых концентрациях, но обладала большой силой. Инфицирующей единицей, как было установлено позже, оказалась крошечная, замкнутая в кольцо одноцепочечная нить РНК, которая в физиологических условиях существует в форме компактной, плотно упакованной и свернутой структуры. Вскоре эта структура была визуализирована под электронным микроскопом. При наложении ее на изображение ДНК-содержащего бактериофага T7 она выглядела как крохотное пятнышко на фоне переплетенных нитей генома бактериофага. Этот класс инфекционных агентов, которые посчитали субвирусными, получил наименование вироидов. В 1978 году вирус веретеновидности картофельных клубней стал первым патогеном эукариот, у которого была расшифрована полная последовательность генома. Открытие вироидов стало научным водоразделом, открывшим эру геномики.

К сегодняшнему дню описаны более тридцати видов вироидов, принадлежащих к двум четко различающимся семействам (Flores et al., 2014; Tsagris et al., 2008; Tabler, Tsagris, 2004; Flores et al., 2005; Daros, Elena, Flores, 2006). Эти вироиды инфицируют множество других растений, среди которых экономически важные сельскохозяйственные культуры, такие как цитрусовые, баклажаны, кокос и авокадо, а также такие декоративные растения, как хризантемы и колеусы. Все вироиды имеют геном, состоящий из одноцепочечной РНК длиной 246–401 нуклеотид — это приблизительно в десять раз меньше, чем геном самого мелкого бактериофага. Геном кольцевидный и компактно свернут благодаря наличию водородных связей между нуклеотидами, которые определяют образование комплементарных пар и сложной вторичной структуры. Наиболее примечательным аспектом вироидов является то, что их генетический материал не кодирует белков, но они способны эффективно организовывать свою репликацию и передачу между клетками и даже между разными растениями. По причине своей невероятной простоты они выработали способы использовать исключительно клеточные белки для поддержания своего существования. Вироиды — это убедительная иллюстрация того, что образование фенотипа вовсе не является прерогативой белков. Вироиды напоминают нам о том, что последовательности оснований нуклеиновых кислот сами по себе могут определять функции и фенотип. Первичная нуклеотидная последовательность вироидов «кодирует» все сигналы, необходимые для рекрутирования клеточных функций и их использования для репликации и передачи инфекционных частиц; эта последовательность определяет фенотип, экспрессируемый вироидом. Именно этот фенотип должен быть объектом давления естественного отбора. Несмотря на ту особенность, что вироиды не кодируют белки или капсид, они тем не менее отвечают критериям независимо развивающейся эгоистической генетической информации: в моей книге они считаются по своей сути вирусами.

Формы существования вироидов отнюдь не просты и различны у двух семейств: Pospiviroidae, представителем которого является веретенообразный вирус картофельных клубней (обратите внимание на -oid в названии семейства, это особенность обозначения вироидов), и Avsunviroidae, типичным представителем которого является вироид «загара» авокадо. После внедрения в растительную клетку, вероятно, через структуры плазмодесмосом соответствующие вироиды выбирают себе сайт для репликации. Посповироиды включаются в ядро, а авсунвироиды — в хлоропласт. Оказавшись в органелле-мишени, каждый вироид производит одно и то же, поистине замечательное действо: они мобилизуют клеточную ДНК-зависимую РНК-полимеразу для осуществления своей репликации. В ядре посповироиды мобилизуют РНК-полимеразу II, которая обычно отвечает за транскрипцию всех кодирующих клеточные белки генов. В хлоропласте авсунвироиды используют кодируемую в ядре хлоропластную РНК-полимеразу. Геном реплицируется по механизму вертящегося круга (rolling circle) с образованием олигомерных репликационных интермедиатов, которые расщепляются на фрагменты нужной длины, а затем конформируются в кольцевидную форму. На этом последнем этапе вироиды двух семейств ведут себя по-разному: реплицирующиеся в ядре посповироиды мобилизуют клеточные ферменты для процессинга генома, а авсунвироиды «кодируют» рибозим в форме молота (Cech, 1993; Hutchins et al., 1986), который отвечает за автокаталитическое созревание геномной РНК. Через плазмодесмосомы вироиды перемещаются внутри растения между клетками, а на большие расстояния распространяются по сосудистой системе растений, вероятно, в комплексе с белками растения. Передача между растениями осуществляется разнообразными способами, часто с семенами или пыльцой, но самым эффективным способом является вегетативная передача. Зафиксированы примеры передачи между отдельными растениями тлями, и было также показано, что между кустами помидоров вироид веретеновидности картофельных клубней переносят медоносные пчелы (Florees et al., 2005). Многие аспекты репликации и патогенности вироидов остаются неясными, так же как их загадочная способность изменять субстратную специфичность РНК-полимеразы хозяина, позволяющая использовать ее не на ДНК-, а на РНК-шаблоне. Неизвестны также механизмы внутриклеточного транспорта; например, неизвестно, каким образом РНК авсунвироидов проникает в хлоропласт. Вероятно, самый таинственный аспект вироидной инфекции — способность вироидов вызывать самые разнообразные болезненные поражения у инфицированных растений. Является ли это результатом захвата важных клеточных функций? Вероятно, нет, потому что некоторые вироиды вообще не оказывают на инфицированные растения вредоносного влияния. Недавно выполненная работа позволяет предположить, что частная патология, вызываемая вироидами, обусловлена нарушением направленности антивирусной защиты самого растения, вызванным вироидом (Flores et al., 2005). С полной уверенностью мы можем заключить лишь, что генетическая информация, организующая весь репертуар репликационных стратегий и заболеваний, вызываемых вироидами (их фенотипы), заключена в 246–401 нуклеотид- одинарной цепи РНК. Эта РНК не кодирует ни одного белка. Представляется, что в клетках действует сама нуклеотидная последовательность; но как она действует? Должно быть, какие-то важные свойства заложены в первичной нуклеотидной последовательности вироида, которая, в свою очередь, обусловливает образование вторичной структуры путем свертывания РНК-генома в сложную трехмерную структуру, аналогично свертыванию последовательности аминокислот в трехмерную структуру белка.

Очевидно, что возможно прямое физическое взаимодействие вироидного генома с клеточными белками хозяина, и, соответственно, был предложен возможный механизм, опосредующий транспорт вироида веретеновидности картофельных клубней в ядро растительной клетки. Эта гипотеза подкрепляется фактом прямого и специфического связывания РНК вироида веретеновидноти картофельных клубней с клеточным бромсодержащим белком, которое, как полагают, играет регуляторную роль в ремоделировании клеточного хроматина (Martinez de Alba et al., 2003). Образующийся в результате рибонуклеопротеиновый комплекс перемещается в ядро, где имеет место репликация вироида веретеновидности картофельных клубней и где, возможно, осуществляется влияние этого комплекса на регуляцию активности клеточных генов. Вероятнее всего, первичная нуклеотидная последовательность вироида получает преимущество как главное действующее лицо, определяющее патогенность вироида. Ответ растения-хозяина на репликацию вироида, как теперь известно, предусматривает посттранскрипционное подавление активности клеточных генов (Famens et al., 2008), развившийся в древности защитный механизм, нацеленный на проникшие в клетку нуклеиновые кислоты. Те же процессы участвуют в образовании нуклеотидных последовательностей специфических микро-РНК и малых интерферирующих РНК [small interfering RNA (siRNA)], которые участвуют в регуляции развития как растительных, так и животных организмов (Carrington, Ambros, 2003). Известно, что в растениях образуются siRNA, которые специфически сдерживают и тормозят репликацию вироидов, и ученые предполагают, что такие, нацеленные на вироиды siRNA могут играть роль в патогенности вироидов, влияя на транскрипты генов самой клетки. Несколько таких матричных РНК-мишеней уже описаны, но ученые пока далеки от понимания разнообразных механизмов, посредством которых эти крошечные РНК-геномы манипулируют клетками организма-хозяина (Gago-Zachert, 2016; Flores et al., 2015).

Эволюционный реликт

Вироиды — это эгоистичные репликоны РНК, независимо от того, считать ли их вирусами или субвирусами (вироидами) из-за того, что они не развили у себя способности кодировать капсиды или любые другие белки. Вироиды реплицируются с помощью склонных к ошибкам РНК-полимераз, и, следовательно, можно ожидать, что частота мутаций будет соответствовать частоте мутаций, характерной для РНК-содержащих вирусов вообще. Таким образом, они должны существовать в клетках хозяев в форме квазивидов. Частота мутаций вироидов, так же как вирусов, зависит от частоты появления ошибок при построении нуклеотидных последовательностей новых геномов. Темп эволюции не отражает истинную частоту таких мутаций, потому что возникающие вследствие замещения нежизнеспособные геномы удаляются из популяции. Минималистский геном, такой как у вироидов, способный направлять каскад сложных биологических функций, будет находиться под очень сильным селективным ограничением. Более крупные вирусы, которые кодируют белки, могут выдерживать больше мутационных изменений; синонимичные мутации (мутации, не меняющие последовательность аминокислот в белках) не сказываются на жизнеспособности вирусов. Не так обстоят дела у вироидов, так как их генетическая информация никоим образом не является избыточной; ее характеристическая нуклеотидная последовательность непосредственно связана с вироидным фенотипом. Тем не менее in vivo наблюдали полиморфизм нуклеотидных последовательностей и вариации последовательностей; это своего рода квазивиды, хотя и относительно небольшой сложности. Испанские ученые измерили частоту мутаций вироидов, они использовали изощренные экспериментальные техники для выявления и подсчета мутаций, возникающих во вновь синтезированных вироидных геномах до того, как отбор сможет удалить их из популяции (Gago et al., 2009). Результаты оказались впечатляющими. Частота мутаций составила 0,0025 на один включенный нуклеотид, что эквивалентно одной мутации на один новый геном. Эта скорость мутаций, превосходит скорость мутаций в генетическом материале РНК-содержащих вирусов, которые мы обсуждали в первых главах. Ученые пока не решили, почему это происходит, но некоторые полагают, что надежность включения нуклеотидов может нарушаться под воздействием нескольких факторов. Один из важных факторов заключается в том, что вироиды извращают нормальную функцию ДНК-зависимой РНК-полимеразы хозяина, заставляя ее использовать чуждый шаблон РНК. Ранее мы уже обсуждали ограничения размеров генома, которые накладываются частотой мутаций РНК-содержащих вирусов. Можно ожидать, что катастрофа ошибок является следствием избытка мутаций на одну копию генома, и Эйген заметил, что существует прямо пропорциональная зависимость между размером генома и частотой мутаций в разных репликонах, будь то вирусы, бактерии или более крупные многоклеточные организмы (Biebricher, Eigen, 2005). Можно, следовательно, предположить, что при минимальном размере и относительном отсутствии избыточности вироидных геномов частота их мутаций накладывает определенные ограничения на способность геномов к расширению. Эволюция, направленная на повышение надежности, должна идти рука об руку с любым увеличением размера генома, что сопровождается эволюционным нарастанием его сложности.

Сравнительный геномный анализ вироидов позволил обнаружить убедительные аргументы в пользу того, что они возникли из общего и очень древнего предкового РНК-репликона (Flores et al., 2014). Это положение верно как для посповироидов, так и для авсунвироидов, несмотря на разницу в способе их существования. Ядерные посповироиды используют клеточные ферменты для превращения продуктов своей репликации в отдельные кольцевые РНК соответствующей геному длины, в то время как авсунвироиды обладают молотовидной рибозомной последовательностью, которая выполняет ту же задачу в автокаталитической реакции копирования РНК. По этой причине некоторые ученые считают, что авсунвироиды представляют собой наиболее древнюю форму вироидов, которые ближе к наиболее примитивному, центрированному вокруг РНК миру. Было высказано предположение о том, что они существовали как репликоны цианобактерий, которые (репликоны) затем вторглись в эукариотические клетки и превратились в симбиотические хлоропласты. Впоследствии предковый вироид, видимо, покинул органеллу и проник в ядро, а после дивергенции образовал вторую линию автономно реплицирующихся кольцевых РНК, которые приобрели свойства белков, присутствующих в ядре.

Природа вироидов как содержащих исключительно РНК репликонов порождает множество вопросов относительно их эволюционного происхождения: не являются ли вироиды древними ископаемыми остатками, представляющими промежуточный продукт в эволюции доклеточной жизни, которые сохранились в клетках, как сохраняются в янтаре древние насекомые? В настоящее время практически все ученые согласны в том, что РНК является предшественницей всего живого; РНК способна записывать информацию и служить биокатализатором (Cech, 1986b). Джеймс Уотсон, нобелевский лауреат, один из первооткрывателей двойной спирали ДНК, однажды признал, что уже в 1968 году Фрэнсис Крик, его ближайший сотрудник, высказал предположение о том, что РНК может служить не только шаблоном, но также и ферментом, осуществляющим свою собственную репликацию (Watson, 1993). В наше время этот взгляд приобрел всеобщее признание; первым генетическим материалом доклеточной жизни была РНК, а первыми репликонами были полимеры на основе РНК. Только после возникновения ДНК и белков эти соединения оттеснили РНК, отведя ей современную подчиненную роль в эволюции клеточных форм жизни. Тем не менее мы легко можем представить себе, что когда-то органический мир был миром РНК. Следует в этой связи вспомнить открытие рибозимов, последовательностей РНК, которые автокаталитически опосредуют вырезание интронов из рибосомных РНК-транскриптов в эукариотических водорослях (Kruger et al., 1982). Цех, кроме того, смог показать, что современные рибосомы, наши клеточные фабрики, синтезирующие белки, являются по своей сути сложными рибозимными структурами, встроенными в белковый остов (Cech, 2000). Автокаталитические интроны были предложены на роль прототипа самых ранних репликонов РНК, из которых возникла жизнь (Sharp, 1985; Joyce, 1989; Cech, 1986a). Если это так, то отсюда следует, что вироиды образовались позже, чем уцелевшие интроны. Впоследствии, однако, Тед Динер, «отец» вироидов, высказал аргументированное возражение. Он предположил, что не интроны были предшественниками вироидов, а наоборот, вироиды — предшественниками интронов (Diener, 1989).

Несколько ученых вывели эволюцию вироидов от теоретического предшественника, который мог быть мелким автономным РНК-репликоном длиной, возможно, не более нескольких нуклеотидов. Более длинные цепи нуклеотидов не могли быть жизнеспособными, если бы частота неверного включения нуклеотидов была слишком высокой. Такие полимеры РНК, как можно полагать, объединялись с образованием более крупных «геномов»; in vitro было показано, что рибозимы могут связываться в молекулу РНК, если их поместить на шаблон (Doudna, Szostak, 1989). Далее, ученые предположили, что такие геномы могли впоследствии повторно образовывать копии последовательностей. Есть данные, подтверждающие такой взгляд; компьютерный анализ состава большинства вироидных геномов выявил основную периодичность нуклеотидных последовательностей, с величиной периодов в двенадцать, шестьдесят или восемьдесят нуклеотидов (Jugasz, Hegyi, Solymosy, 1988). Вероятно, здесь коренится механизм расширения РНК-геномов путем тандемной дупликации фрагментов (Diener, 1989); помимо создания мозаичных ансамблей, это могло стать механизмом, лежащим в основе эволюции вироидных геномов. Был высказан и еще один аргумент в пользу того, что размер генома практически ограничен частотой ошибок в репликоне. Принятие модели репликации по механизму вращающегося круга позволяет объяснить увеличение размеров дочерних геномов в сравнении с родительскими геномами. Полагают, что результирующий избыток информации, содержащейся в этих продуктах репликации, является основой обхода ограничений на частоту мутаций в этих простых геномах, где она и без того была высока. Повторение информации гарантирует, что каждый геном содержит функционирующие формы всех необходимых генетических элементов; в такой ситуации гарантировано сохранение по крайней мере одного жизнеспособного генома (Flores et al., 2014).

Все вместе эти предположения отводят вироидам место исходных доклеточных репликонов. Если это действительно так, то можно лишь удивляться тому, что они смогли сохранить заметные признаки своих предков, несмотря на огромную эволюционную дистанцию между ними. Мы поместили их в древние (гипотетические) цианобактерии, а также в хлоропласты и ядра эукариотических растительных клеток. Если все же они являются эволюционными реликтами первичных РНК-содержащих паразитов, то становится трудно примирить их исключительную привязанность к покрытосеменным и полное их отсутствие в других царствах живых существ (Koonin, Dolja, 2014). Вероятно, это стало следствием вымирания и замещения следующими генетическими линиями с уже развитым способом существования, но вполне вероятно, что со временем будет выдвинута и другая объясняющая гипотеза. Некоторые эволюционисты высказываются в пользу возможности того, что вироиды могут быть предками определенных мобильных генетических элементов, другие же считают, что они все же являются предшественниками современных интронов, которые обнаруживаются практически во всех эукариотических РНК-транскриптах, но есть и такие ученые, которые полагают, что объяснение их происхождения следует искать в их эволюции после возникновения растительного мира.

Надо сказать несколько слов и о сателлитных РНК (или вирусоидах). Это мелкие, автономно реплицирующиеся РНК-геномы (также кольцевидные), сходные по природе и способу существования с вироидами. Ключевое различие, однако, заключается в том, что им требуются хелперные вирусы для передачи между разными клетками хозяина. Этот (возможно, несколько искусственный) способ существования ставит их вне моего (и без того уже очень широкого) определения вируса, поэтому я не стану дальше углубляться в эту тему. Должен, однако, признать, что впечатление об их родстве с вироидами неизбежно, и они живо иллюстрируют, как эгоистичная генетическая информация может с успехом использовать различные подходы для самосохранения и распространения. Опора на другие вирусы (или вироиды) ради поддержания размножения является отходом от способа существования вироидов, но сам этот факт открывает перед нами крепко запертые прежде двери. Вирус гепатита дельта, сателлитный вирус человеческих клеток, служит одним из примеров; исторически его сначала «взял под крыло» неродственный, но обычный, образующий свою оболочку, хелперный вирус. Представляется правдоподобным, что вирус гепатита D является потомком вироида, который проник и укрепился в определенных эукариотических клетках, как экзогенный паразитический агент.

Мегавирусы: самые крупные

В 1992 году Тим Роуботам поднялся на крышу Королевской больницы в Брэдфорде в английском графстве Йоркшир, чтобы взять пробы из находившейся на крыше водонапорной башни. Роуботам был прикрепленным к больнице научным сотрудником лаборатории Управления здравоохранения в Лидсе, находящегося в двадцати милях от Брэдфорда. Задачей Роуботама было выяснить источник вспышки пневмонии в больнице. Подозревали, что причиной больничной эпидемии стала бактерия, похожая на легионеллу. Бактерии, которые он искал, представляли собой напоминающие легионеллу внутриклеточные патогены, поражающие амеб, которые при определенных условиях могли попасть в систему водоснабжения больницы. Вернувшись в Лидс, Роуботам попытался культивировать бактерию вместе с амебой, чтобы выделить с их помощью интересовавшую его бактерию. В воде действительно обнаружились грамотрицательные болезнетворные бактерии из рода легионеллы; кроме того, в воде содержалась и грамположительная бактерия, которую Роуботаму не удалось идентифицировать. Этот новый микроорганизм был окрещен «брэдфордским кокком». Бактерию описали и хотели сдать в архив, так как она в итоге не являлась причиной вспышки заболевания в госпитале.

Одиннадцать лет спустя эту пробу воды снова подвергли исследованию. Доктор Ричард Бертлз прибыл в лабораторию профессора Дидье Рауля в Марселе. Лаборатория Рауля — это один из многих национальных центров Франции, где исследовали риккетсии и другие внутриклеточные бактерии, а у Бертлза было несколько молекулярных методов для характеристики нового вида бактерий. Бертлз привез с собой несколько проб, среди которых была и проба с брэдфордским кокком, которую начали исследовать, применив метод полимеразной цепной реакции. Ген РНК 16S рибосом весьма консервативен и встречается почти у всех видов бактерий, и в первую очередь ученые занялись именно им, для того чтобы изучить ее видообразование в группах бактерий. Пробы, специфичные по этому гену, можно использовать для амплификации РНК и культур и посевов природных бактерий, содержащих прокариотическую ДНК, с помощью которых можно получить материал, пригодный для секвенирования ДНК, которую затем намеревались подвергнуть филогенетическому анализу. Все пробы Бертлза были исследованы этим методом, за исключением брэдфордского кокка. В этой бактерии рибосомальный ген обнаружен не был. Для того чтобы, по крайней мере, визуализировать упрямый микроб и убедиться в том, что методика все же открывает клетку, Рауль прибегнул к электронной микроскопии. Результат перевернул все представления микробиологии: под электронным микроскопом увидели не бактерию, а чудовищный, исполинский вирус. Вирус обладал икосаэдрическим капсидом и по морфологии напоминал вирусы, инфицирующие водных беспозвоночных, — иридовирусы, представителей группы вирусов, называемых ядерно-цитоплазматическими большими ДНК-содержащими вирусами, но обнаруженный вирус был намного крупнее. Его величина достигала половины микрона, а окружавшая его оболочка делала его размер еще больше — 0,75 мк. Это был нефильтруемый инфекционный агент, его обнаружение потребовало изменения определения вирусов, их возможностей, а также бросило серьезный вызов общепринятому мнению о том, что вирусы, в отличие от других форм жизни, не являются живыми, а представляют собой крупные химические соединения, лишенные самостоятельных признаков жизни. Здесь же был вирус, который, подобно бактериальной клетке, был видим под световым микроскопом. Мог ли он обладать таким же сложным строением, как некоторые истинные формы жизни? Обнаруженное чудовище было названо мимивирусом (мимикрирующим вирусом), и с его обнаружения началась новая эпоха в вирусологии.

Рауль быстро связался с Жаном-Мишелем Клаври, работавшим там же, в Марселе, и попросил его секвенировать геном мимивируса и опубликовать полученные данные (La Scola et al., 2003; Raoult et al., 2004). Величина ДНК-генома мимивируса потрясала воображение — геном содержал 1,81 миллиона пар оснований и кодировал около 1000 генов. Геном мимивируса превышает размерами геномы многих бактерий и содержит множество неизвестных генов, почти половину которых биологи не смогли опознать. Остались неизвестными и их функции. Интересно, что в составе генома были обнаружены гены, родственные клеточным генам и обычно не встречающиеся у вирусов. Геном содержал разнообразные гены, определяющие клеточные метаболические функции, а некоторые гены являлись частью механизма клеточной трансляции белка, в частности несколько транспортных РНК и синтазы аминоацил-тРНК. Это функции, которые все прочие вирусы заимствуют у клетки-хозяина (некоторые крупные ДНК-содержащие вирусы содержат гены транспортной РНК, но ни один из них не кодирует ферменты, участвующие в трансляции белка). Мимивирус оказался весьма странным зверем. Тем не менее при инфицировании простейшего животного Acanthamoeba polyphaga в его культуре мимивирус повел себя как настоящий вирус. Сразу же после инфицирования последовала эклиптическая фаза (период, в течение которого не обнаруживаются дочерние инфекционные вирусные частицы) и осуществление каскада экспрессии генов, синтез белка, а затем репликация вирусной ДНК, после чего наблюдалось взрывоподобное высвобождение вируса в течение двадцати четырех часов.

Большие и очень большие

Открытие мимивируса акантамебы побудило вирусологов заново исследовать разнообразные экосистемы в поисках подобных вирусов. Методами вирусной метагеномики обнаружить их не удалось, но этому есть простое объяснение. Во всех прежних поисках вирусов в окружающей среде пробы предварительно пропускали через фильтры с размером пор в 0,2 микрона. В конце концов, того требовало каноническое определение вируса. Хозяевами первого мимивируса оказались простейшие, такие как акантамеба, поэтому ученые в первую очередь принялись исследовать водные экосистемы. От миллиона до триллиона вирусных частиц, которые обычно обнаруживаются в фильтратах океанической воды, не были гигантскими вирусами, поэтому потребовалось более пристальное изучение. Первое указание на то, что океаническая вода может быть богатым источником новых гигантских вирусов, появилось после повторного анализа проб, собранных во время экспедиции «Сорсерер-2», в ходе которой ученые не ограничились размером фильтра 0,2 микрона (Rusch et al., 2007). Большая часть нуклеотидных последовательностей, собранных учеными, была обнаружена во фракции морской воды, пропущенной через фильтр с порами 0,8 микрона. Эти последовательности задерживались фильтром с порами 0,1 микрона. Большая часть этих последовательностей ДНК имела бактериальное происхождение, но в 3% случаев ДНК имела вирусное происхождение (Williamson, Rusch et al., 2008). Повторный анализ этого большого набора данных (в нем оказалось 4,9 миллиарда связанных нуклеотидов) позволил выявить множество генных последовательностей, которые прежде считали темной материей, и, как оказалось, эти последовательности были сходными с последовательностями генома мимивируса (Monier, Claverie, Ogata, 2008). Очень скоро ученым удалось идентифицировать множество сородичей мимивируса (Colson et al., 2012). Это были мамавирус, терра-2, муму, курдо-11 и самый крупный из обнаруженных к тому времени вирусов Megavirus chilensis. В этом обнаруженном у берегов Чили вирусе культивированном в организме пресноводной амебы, был обнаружен геном величиной 1,25 миллиона пар оснований, кодирующий 1120 белков. Более дальний родственник, названный Кро-V (Cafeteria roenbergensis virus), был обнаружен в представителе морского зоопланктона Cafeteria roenbergensis. Совместное культивирование проб воды с различными видами акантамеб было продолжено, благодаря чему были обнаружены новые гигантские вирусы: Marseillevirus был обнаружен в воде башенного охладителя в Париже, а Lausanevirus — в пробах воды из реки Сены. Стало очевидно, что гигантские вирусы одноклеточных эукариот обильно представлены во всех наших экосистемах.

Ученые, идентифицировавшие чилийский мегавирус, обнаружили его в столбе океанской воды. После этого они решили исследовать также и отложения морского дна, предположив, что в них концентрация потенциальных эукариотических клеток-хозяев будет выше. В 2013 году ученые опубликовали отчет о полученных результатах (Philippe et al., 2013): они обнаружили два новых «пандоравируса», которые были выделены из донных морских отложений в прибрежных водах Центральной Чили, а также из отложений пресноводного водоема в Австралии. Геномы включали 1,9 и 2,5 миллиона пар оснований, что больше геномов некоторых паразитирующих эукариот; больший из этих двух вирусов — Pandoravirus Salinas кодирует 2500 белков. Поразительно, но 93% из них — это темная материя. Ни один из этих вирусов предполагаемого нового рода не имел никакого филогенетического сходства с вирусами других семейств, включая Mimiviridae. Эти наблюдения замечательны, но одновременно и очень полезны, ибо проливают свет на скудость наших знаний о мире вирусов и микроорганизмов.

Вирофаги: блоха на блохе

Mimiviridae и Marseilleviridae — новые семейства, пополнившие ряды ядерно-цитоплазматических крупных ДНК-содержащих вирусов, которые, вероятно, произошли от одного общего предка. Это положение подтверждается филогенетической реконструкцией гипотетического общего предкового вируса, в ходе которой были выделены и идентифицированы около сорока ядерных генов (Yutin et al., 2009). Эти гены по большей части расположены в некоторых ядерно-цитоплазматических крупных ДНК-содержащих вирусах и обеспечивают фундамальные функции, лежащие в основе способа существования невероятно разнообразного царства вирусов. Размеры их геномов варьируют в широчайших пределах — от 0,2 до 1,25 миллиона пар оснований; при этом молекулы ДНК могут быть линейными или кольцевыми, а реплицироваться вирусы могут как в цитоплазме, так и в ядре клетки. Хозяевами могут быть самые разные организмы — от людей и птиц до насекомых, червей, водорослей, зоопланктона и других фагоцитирующих простейших. Тем не менее все эти вирусы должны реплицировать свою ДНК и окружать капсидами свои геномы, и они делают это с помощью одного и того же набора инструментов, закодированных набором ядерных генов; во всей группе ядерно-цитоплазматических крупных ДНК-содержащих вирусов только пять генов обнаруживаются у всех представителей этого класса вирусов. В этом отношении у них много общего с вирусами герпеса, у которых тоже есть основополагающий набор ядерных генов. Ядерные гены вирусов герпеса дополняются вспомогательными генами, которые сообщают функциям вируса многие дополнительные свойства, обеспечивающие взаимную адаптацию вирусов и хозяев. Эта особенность характерна и для поксвирусов, которые сами являются ядерно-цитоплазматическими крупными ДНК-содержащими вирусами, обладающими разнообразными генами, влияющими на проникновение вирусов в организмы разных хозяев и обеспечивающими взаимодействие вирусов с ними. Размер генома крупнейшего мимивируса приблизительно в десять раз превосходит геном мельчайшего поксвируса, который кодирует всего 130 генов. Таким образом, гигантские вирусы могут позволить себе роскошь в высшей степени гибкого генома с огромным адаптивным потенциалом.

Первые ультраструктурные исследования инфицированных мимивирусом клеток, выполненные Раулем и его коллегами, привели к заключению о том, что репликация и сборка вируса происходят в ядре, как у вирусов герпеса (La Scala et al., 2003). Однако более детальное исследование выявило, что ядро оттесняется к периферии клетки и замещается новыми структурами. Вирус строит крупные «вирионные фабрики», и сборка вирусных частиц осуществляется в цитоплазме клетки (Suzan-Monti et al., 2007; Novoa et al., 2005). Эти временные структуры, построенные вирусом в клетке, создают рабочее пространство, куда инфицированная клетка поставляет необходимые ресурсы для экспрессии вирусных генов, репликации генома и морфогенеза вириона. Таких структур ученые в клетках до тех пор не видели. Эти структуры имели мало общего с вирусными фабриками, описанными при исследовании поведения других ядерно-цитоплазматических крупных ДНК-содержащих вирусов. Под электронным микроскопом мимивирусная фабрика напоминала связанную с клеточной мембраной органеллу и даже, пожалуй, бактерию. Некоторые ученые уподобили эту структуру воссозданию временно возникающего живого микроорганизма внутри инфицированной клетки. Семя сомнения было посеяно, и научное сообщество раскололось. В какое место эволюционной схемы надо помещать такие вирусы? Не являются ли они реликтами четвертого царства жизни? Дело не только в том, что геном мимивируса содержит генетический материал, который отсутствует у эукариот, бактерий и простейших; геном мимивируса кодирует белки, обладающие теми функциями, которые обеспечиваются при заражении другими вирусами генетического аппарата инфицированной клетки. Сложность генома мимивируса можно сравнить со сложностью генома многих живых клеток; похоже, что этот гигантский вирус существует в виде псевдо-микроорганизма, во всяком случае, в период цикла репликации внутри клетки-хозяина.

Было обнаружено, что вирусные фабрики инфицированных мимивирусом клеток поддерживают репликацию вирусного паразита, называемого спутником (Scola et al., 2008). Исследователи, занятые в этой сфере вирусологии, очень скоро обнаружили, что спутник инфицирует исключительно пораженные мимивирусом клетки и его репликация и сборка происходят только на расположенных в цитоплазме мимивирусных фабриках. Это свойство отличает спутника от сателлитных вирусов, которые образуют капсид для перехода в следующую клетку с помощью хелперного вируса. У спутника есть свой собственный капсид и аппарат морфогенеза, а патогенным он является для самого мимивируса, так как снижает эффективность его репликации и ослабляет цитопатическое воздействие на клетку. Этот класс вирусов был назван вирофагами, пожирателями вирусов. Некоторые ученые возражают, что использование термина «вирофаги», намекающего на сходство этих вирусов с бактериофагами, поражающими бактерии, вводит в заблуждение (Krupovic, Cvirkaite — Krupovic, 2011). Сторонники термина, однако, считают, что он подчеркивает свойства хозяина, которые проявляют невероятно сложные, напоминающие микроорганизмы мимивирусы. Противники же говорят, что лучше называть спутник сателлитным вирусом, ведь гигантские вирусы не являются автономно реплицирующимися организмами-хозяевами и, несмотря на всю свою сложность, вынуждены опираться на клетку-хозяина, чтобы привести в действие свои механизмы, так же как все остальные вирусы. Для своих вирофагов они выступают в роли все тех же хелперных вирусов.

В течение пяти лет было идентифицировано довольно много новых вирофагов, например, мавирус, инфицирующий клетки акантамебы, сам инфицируется вирусом Cafeteria roebergensis. Органический озерный вирофаг был «опознан» по гомологичным последовательностям в метагеномной ДНК, обнаруженной в одном соленом озере в Антарктиде; считают, что он паразитирует на ядерно-цитоплазматических крупных ДНК-содержащих вирусах, инфицирующих зеленые водоросли. Все эти паразиты являются вирусами, содержащими двухцепочечную ДНК, составляющую геном, кодирующий около двадцати генов, и, как и их хозяева, имеют несколько общих генов, в частности генов, кодирующих белки, участвующие в морфогенезе капсида, что позволяет говорить об их монофилетическом происхождении (Krupovic, Raoult, Koonin, 2013). Сходство нуклеотидных последовательностей было отмечено между генами вирофагов и последовательностями класса мобильных генетических элементов, названных мавериками или полинтонами (Yutin, Raoult, Koonin, 2013). Их находят в эукариотических клетках множества беспозвоночных и простейших, что позволяет предполагать их очень древнее происхождение. Четвертый вирофаг, спутник-2, был выделен из жидкости, в которой находились контактные линзы больного, страдающего амебным кератитом. Сама амеба оказалась инфицированной неизвестным гигантским вирусом, названным вирусом Lentille. К удивлению ученых, выяснилось, что очищенные вирусные частицы лентилле переносили спутник-2 в инфицированные амебные клетки. ДНК вирофага была внедрена в геном гигантского вируса; можно сказать, что это был «про-вирофаг». По аналогии с фагами прокариот и ретровирусами эукариот, вирофаги способны к ассоциации с геномами своих хозяев, что позволяет вирофагам вертикально передаваться в дочерние вирусные частицы, а также в клетки, пораженные этими вирусами (Desnue et al., 2012).

В действие вступил также и третий игрок. Анализ нуклеотидных последовательностей вируса лентилле показал, что в их составе присутствует новый генетический элемент, представленный в виде кольцевых копий в вирусных частицах, но также и в виде элементов, включенных либо в сам вирусный геном, либо в последовательность нуклеотидов вирофага. Этот элемент был назван трансповироном, мобильным генетическим элементом длиной 7–8 тысяч пар оснований, включенным в экосистемы гигантского вируса и его вирофага. Подобно вирофагам, трансповироны во многих отношениях напоминают маверики (полинтоны), но в большинстве случаев они вкраплены в геном вируса в виде мозаики генетических элементов, заимствованных из разных, не родственных друг другу источников (Desnues et al., 2012). Подобно геномам высших эукариотических клеток с их достоверным набором перемещаемых в обе стороны элементов или геномам бактериальных клеток с их популяциями транспозонов и профагов, гигантские вирусы располагают своими собственными мобиломами. Могут ли эти мобильные генетические элементы быть частью разнообразных дополнительных генов гигантских вирусов, поддерживающей их предрасположенность к приобретению новой генетической информации путем горизонтального переноса генов?

Химеризм

Эти рассуждения были подкреплены несколькими работами, выполненными марсельскими учеными Раулем и Ла-Скалой совместно со специалистом по эволюционной генетике Юджином Куниным (Koonin, Dolja, Krupovic, 2015a; Koonin, Krupovic, Yutin, 2015; Aherfi et al., 2014). Эти ученые опубликовали много работ, посвященных эволюционному происхождению генов крупных ядерно-цитоплазматических ДНК-содержащих вирусов, и предложили выделить новый порядок вирусов — Megavirales. Теперь, вместе с пониманием биологии этих вирусов, стало вырисовываться понимание картины, примиряющей различные эволюционные траектории в пределах этой разнообразной группы патогенов. Открытие марсельского вируса как нового представителя порядка Megavirales предоставило нам информацию о многих аспектах их эволюции. Геном этих вирусов содержит набор из двадцати восьми предковых ядерных генов, которые присутствуют у всех представителей нового порядка вирусов. Остальные гены в ходе эволюции произошли от генов существ из всех царств жизни: эукариот, бактерий и простейших. Есть также данные о том, что гены семейств с различными функциями возникали в результате дупликации и амплификации генов, то есть происходило то же, что мы видели в эволюции эукариотических геномов и геномов вирусов герпеса. Восемьдесят генов марсельского вируса имеют тесное филогенетическое родство с генами амебы; некоторые гены обнаруживаются также в геномах мимивирусов, но у других представителей Megavirales они обнаружены не были. Все вместе эти данные позволяют предполагать, что эти крупные ДНК-содержащие вирусы приобрели сложный геном в результате горизонтального переноса генов от других организмов, а также от других вирусов, например мимивирусов. Бойер и его коллеги (2009) предположили, что амебы могут представлять собой генетический плавильный котел, где возникают химерические микроорганизмы. Авторы подчеркивают, что фагоцитирующие амебы инфицируются многими вирусами и бактериями, так как преимущественно питаются элементами размером около 0,2 микрона. Амебы могут служить сосудами для смешивания микробной генетической информации, что способствует появлению новых генотипов. Нельзя недооценивать потенциально важную роль мобильных генетических элементов в этом процессе. В самом деле, важную роль в нем могут играть и вирофаги. Та же группа ученых убедительно показала, что вирофаги паразитируют в широком диапазоне хозяев, эффективно инфицируя различные виды Mimiviridae. Таким образом, вирофаги могут быть полезными, как переносчики в процессе горизонтальной передачи генетического материала между разными представителями порядка Megavirales.

В какой-то мере это зеркальное отражение прокариотической жизни и работы бактериофагов; эволюция вирусов из порядка Megavirales основана на двух механизмах: на вертикальной передаче наследственности в виде набора ядерных генов и на горизонтальном переносе генов, заимствованных у представителей всех царств жизни. Эти вирусы являются геномными химерами, собранными, как лоскутные одеяла с невероятно сложным и разнообразным рисунком, в котором содержится все генетическое разнообразие метагенома Megavirales.

Происхождение мегавирусов: в основе маверики

Вирусологи всего мира задались вопросом: почему вирус должен быть таким большим и зачем ему нужно так много генетической информации? Не ставит ли это под вопрос все наши воззрения на эволюционное происхождение Megavirales, вирусов вообще и даже всех остальных трех царств жизни? При отсутствии отчетливых указаний на конкретного предка Megavirales некоторые ученые предположили, что они возникли из какой-то четвертой формы клеточной жизни, ныне вымершей, а затем выродились до паразитизма в результате утраты генов и эволюционировали по описанному выше механизму. Это очень соблазнительная идея, так как сложность гигантских вирусов не укладывается в представления о минимализме и экономности генетического материала вирусов. Правда, сравнительная геномика (по крайней мере, для меня) положила конец этим надеждам и гипотезам. Несколько наблюдений не оставили камня на камне от этого предположения, так как более вероятен иной, альтернативный эволюционный сценарий. Одно из самых убедительных положений, лежащих в основе предположения о том, что Megavirales возникли в результате редукции предковой клеточной формы, заключается в том, что эти вирусы обладают разнообразными генами с метаболическими функциями, которые обычно связывают с клеточными формами жизни. В особенности это касается компонентов, характерных для клеточного аппарата трансляции белков. После того как стало доступным большое собрание геномных нуклеотидных последовательностей, специалисты по эволюции вирусов смогли исследовать филогенетические взаимоотношения этих генов между собой и с другими формами жизни (Koonin, Dolja, Krupovic, 2015b; Koonin, Krupovic, Yutin, 2015). Поразительное наблюдение заключалось в том, что эти гены были близкородственны генам организмов, имевших самое разнообразное эволюционное происхождение. Другими словами, гены приобретались гигантскими вирусами в разное время и от разных хозяев. Если бы эти вирусы произошли от общего древнего клеточного предка, обладавшего уникальным механизмом синтеза белка, то разумно было бы ожидать филогенетического родства между этими белками. Но в действительности они имеют разное происхождение. Можно, конечно, привлечь альтернативные сценарии, согласно которым множественные клеточные предшественники породили различные группы Megavirales, но пока нет никаких убедительных данных, подтверждающих такой, в высшей мере невероятный сценарий.

Самое правдоподобное объяснение происхождения Megavirales (все они являются ядерно-цитоплазматическими крупными ДНК-содержащими вирусами) основано на недавнем наблюдении, согласно которому мобильные генетические элементы, называемые мавериками (или полинтонами), имеют в своих геномах гомологичные гены, кодирующие вирусный капсид. Мало того, структурные особенности генов, кодирующих белки их капсидов, напоминают гены всех ядерно-цитоплазматических крупных ДНК-содержащих вирусов, кодирующие белки капсидов. Кунин предположил, что на самом деле полинтоны, которые в настоящее время существуют как мобильные генетические элементы, были, вероятно, прежде обычными вирусами с внеклеточной передачей путем циклов инфицирования, то есть это группа полинтовирусов (Koonin, Krupovic, Yutin, 2015). Эволюционная нить, протянутая от полинтовирусов до Megavirales, сохранила аппарат морфогенеза капсида, гены которого одинаковы у всех этих вирусов. Такое же происхождение, по-видимому, имеют и вирофаги. Эволюция от гипотетических полинтовирусов Кунина до нынешнего порядка Megavirales была весьма непростой, в ней происходили множественные и частые события независимой горизонтальной передачи генов от других вирусов, мобильных генетических элементов и клеточных геномов. Тем не менее сейчас практически нет сторонников гипотезы о том, что эти гигантские вирусы некогда были давно утраченной линией четвертого царства клеточной жизни.

Источник: ЭЛЕМЕНТЫ БОЛЬШОЙ НАУКИ