Большая международная команда биологов отсеквенировала геном европейского ланцетника и провела его всесторонний функциональный анализ, а затем сравнила полученные результаты с данными по позвоночным. Исследование позволило лучше понять, как повлияли на эволюционную судьбу позвоночных две полногеномные дупликации, произошедшие у их далеких ланцетникоподобных предков. Следствием порожденной дупликациями «генетической избыточности» стало радикальное усложнение системы регуляции многих генов — регуляторов развития. Дупликации создали по четыре копии («онолога») каждого предкового гена. Судьба онологов в дальнейшем складывалась по-разному. Вероятность того, что онологи поделят функции и сохранятся, а не будут утрачены за ненадобностью, была выше у генов, чьи функции связаны с регуляцией развития. Часто одни онологи сохраняли широкий спектр предковых функций, тогда как другие онологи из той же исходной четверки специализировались на отдельных аспектах старых функций или приобретали новые. Специализация сопровождалась приобретением новых регуляторных участков, то есть усложнением регуляции работы гена. В результате позвоночные приобрели широкий репертуар специализированных, сложно регулируемых генов, которые, скорее всего, во многом и отвечают за удивительное морфологическое разнообразие и эволюционный успех позвоночных.
Рис. 1. Личинка европейского ланцетника Branchiostoma lanceolatum.
В 1970 году японский генетик Сусуму Оно предположил, что на заре эволюции позвоночных произошла одна или две полногеномные дупликации. В дальнейшем появлялось всё больше фактов, подкрепляющих эту гипотезу. Сильнейшие аргументы в пользу гипотезы Оно дало изучение генома флоридского ланцетника Branchiostoma floridae, прочтенного в 2008 году. На сегодняшний день считается доказанным, что позвоночные на ранних этапах своей эволюции претерпели две полногеномные дупликации (то есть учетверение всего генома). У предков костистых рыб позднее произошла еще одна (третья) полногеномная дупликация.
Дупликации привели к резкому росту генетической избыточности. Появившиеся «лишние» копии генов, в том числе тех, что регулируют онтогенез и определяют план строения организма, получили возможность эволюционировать в разных направлениях, приобретая новые функции (неофункционализация) или специализируясь на отдельных аспектах старой функции (субфункционализация). В результате система генетической регуляции онтогенеза у позвоночных радикально усложнилась по сравнению с исходным (до дупликаций) состоянием, сохранившимся у ланцетника. Считается, что именно этим во многом объясняется эволюционный успех и удивительное морфологическое разнообразие позвоночных животных.
Чтобы лучше понять молекулярно-генетические основы эволюции позвоночных, важно выяснить, как изменилась после дупликаций регуляция экспрессии генов на разных стадиях развития. В качестве «точки отсчета» при этом удобно использовать опять-таки ланцетника, которого недаром называют «живой упрощенной схемой хордового животного». И по морфологии, и по геномной организации ланцетник не слишком далеко ушел от общего предка хордовых, и поэтому его традиционно используют как некий «суррогат» этого давно вымершего предка. Хотя, конечно, нужно помнить, что ланцетник сам прошел с тех пор не менее длинный эволюционный путь, чем человек или лягушка (если мерить длину пути в годах или поколениях, а не в изменениях морфологии или онтогенеза).
Журнал Nature опубликовал большую статью международной группы исследователей, посвященную сравнительной функциональной геномике средиземноморского ланцетника Branchiostoma lanceolatum (рис. 1). Авторы отсеквенировали геном B. lanceolatum с высоким покрытием (150-кратным; для сравнения, в 2008 году геном флоридского ланцетника был отсеквенирован лишь с 12-кратным покрытием). Функциональный анализ генома был проведен с использованием нескольких современных методов (рис. 2). В частности, для 16 возрастных стадий и для 9 тканей взрослого организма были получены транскриптомы при помощи секвенирования РНК. Это позволило сравнить профили экспрессии генов на разных стадиях развития и в разных частях взрослого организма. Активные регуляторные элементы (некодирующие участки ДНК, влияющие на экспрессию соседних генов, например, промоторы и энхансеры), функционирующие на разных стадиях и в разных тканях, идентифицировались при помощи метода ATAC-seq, а данные по промоторам уточнялись при помощи CAGE-seq. Кроме того, анализировались «эпигенетические метки»: метилирование ДНК, метилирование и ацетилирование гистонов. Чтобы было, с чем все это сравнивать, авторы получили недостающие сопоставимые (полученные теми же методами) данные по двум модельным видам костистых рыб — данио-рерио (zebrafish) и японской оризии (medaka). Для сравнения также использовались полученные ранее данные по другим позвоночным (лягушка, курица, мышь).
Рис. 2. Данные, использованные для функциональной аннотации генома ланцетника. Рассматривалось 16 стадий развития (developmental stages) и 9 тканей и органов взрослого ланцетника (adult tissues and organs). Для этих стадий и органов были получены данные по профилям экспрессии генов (RNA-seq), по активным регуляторным элементам (ATAC-seq, CAGE-seq) и по эпигенетическим меткам: метилированию ДНК (MethylC/RRBS), метилированию и ацетилированию гистонов (H3K27me3, H3K27ac, H3K4me3). Цифры в квадратиках означают число повторностей (проанализированных проб).
Размер генома европейского ланцетника — 495,4 млн пар оснований. В нем удалось идентифицировать 20 569 белок-кодирующих генов, а в их окрестностях — 88 391 предполагаемых цис-регуляторных элементов. Для сравнения, у рыбки данио-рерио теми же методами было выявлено 256 018 регуляторных элементов, причем в среднем они, как и у других позвоночных, расположены дальше от белок-кодирующей части гена (точнее, от сайта начала транскрипции), чем у ланцетника.
Общий уровень метилирования ДНК у ланцетника оказался намного ниже, чем у позвоночных. По этому параметру ланцетник больше похож на некоторых беспозвоночных. Однако сходство с позвоночными тоже есть: у ланцетника, как и у позвоночных, уровень метилирования закономерно снижается по мере развития при участии фермента-деметилазы TET, причем этот процесс тесно связан с вступлением в строй новых регуляторных элементов (которые не работают, пока сильно метилированы).
Сравнение профилей экспрессии генов на разных стадиях развития ланцетника и позвоночных подтвердило модель «песочных часов развития». Оказалось (см. рис. 3), что по набору работающих генов ланцетник больше всего схож с позвоночными на средних стадиях эмбрионального развития — в начале так называемой «филотипической» стадии, когда закладываются основные органы. Правда, ланцетник, по сравнению с позвоночными, все-таки стоит немного особняком: наибольшее сходство между ланцетником и позвоночными наблюдается на чуть более ранних стадиях развития, чем те стадии, на которых разные представители позвоночных наиболее сходны друг с другом.
Рис. 3. Подтверждение модели «песочных часов развития»: по профилю генной экспрессии ланцетник больше всего похож на позвоночных (рыб, лягушек, птиц) на средних стадиях эмбионального развития, когда происходит закладка основных органов (в начале так называемой «филотипической» стадии). На графиках по горизонтальной оси отложены стадии развития ланцетника, по вертикальной — минимальное отличие от позвоночных по профилю генной экспрессии (то есть степень различия на той стадии развития данного вида позвоночных, на которой сходство с ланцетником максимально). Серой вертикальной полосой показан период максимального сходства ланцетника с позвоночными по набору экспрессирующихся генов (18–21 часов после оплодотворения, hpf). Справа — диаграмма, показывающая попарное сходство по профилю генной экспрессии отдельных стадий развития ланцетника (вертикальная ось) и данио (горизонтальная ось). Видно, что максимальное сходство наблюдается на средних стадиях развития обоих видов, что соответствует модели «песочных часов развития».
В целом при сравнении экспрессии генов, особенно регуляторных, в ходе индивидуального развития у ланцетника и позвоночных (авторы проводили такое сравнение множеством способов) на первый план выходит глубокое сходство. Оно свидетельствует об эволюционной консервативности «генетической программы развития» базового плана строения хордовых животных. Таким образом, исследование дало новые аргументы в пользу того, что ланцетник представляет собой «живую упрощенную схему» хордового животного не только по своей морфологии, но и по генетическим механизмам регуляции развития.
Но интереснее, конечно, найти не сходство (в котором едва ли кто-то мог всерьез сомневаться), а те различия в генетической регуляции онтогенеза у ланцетника и позвоночных, которые могли бы объяснить удивительное морфологическое и экологическое разнообразие и сложность строения позвоночных. То есть всё то, что так и не развилось у ланцетников за более чем полмиллиарда лет со времени их отделения от предков позвоночных.
Первым делом авторы проверили, усложнилась ли у позвоночных по сравнению с ланцетником регуляция генной экспрессии, и если да, то было ли это усложнение как-то связано с двумя полногеномными дупликациями.
Среднее число регуляторных элементов, приходящихся на один белок-кодирующий ген, у ланцетника значительно меньше, чем у данио-рерио (рис. 4, a). Это подтверждает идею об усложнении генной регуляции у позвоночных. Чтобы понять, связано ли это усложнение с полногеномными дупликациями, ученые рассмотрели по отдельности гены с разным числом сохранившихся у позвоночных копий.
Рис. 4. Среднее число регуляторных элементов, приходящихся на один белок-кодирующий ген у ланцетника (Amphioxus) и рыбки данио-рерио (Zebrafish). Учтены регуляторные элементы, активные на сопоставимых стадиях развития (15 часов после оплодотворения у ланцетника, стадия восьми сомитов у данио). a — в целом для всех генов, имеющихся у обоих видов; b — отдельно для генов с разным числом паралогов (1, 2, 3 или 4), сохранившихся (у мыши) после двух полногеномных дупликаций, произошедших на заре эволюции позвоночных. Мышь здесь возникает из-за того, что у костистых рыб, к которым относится данио, произошла еще одна полногеномная дупликация, так что у них максимально возможное число паралогов равно не четырем, а восьми. Видно, что самая сложная регуляция характерна для генов, все четыре копии которых сохранились у позвоночных, а самая простая — для тех, от которых осталась только одна копия, а три другие были потеряны. с — то же, что b, но только для каждой из четырех групп генов приведены данные по паралогам с самой простой и с самой сложной регуляцией (соответственно, красные и синие прямоугольники). Рисунок показывает, что чем больше паралогов сохранилось, тем сильнее дифференцировалась их регуляция: одни паралоги приобрели очень сложную регуляцию, другие — простую.
Поясним логику этого подхода. Две полногеномные дупликации создали у древних позвоночных по четыре копии каждого предкового гена. Такие копии называют «онологами» (ohnologues) в честь Сусуму Оно. Онологи — это паралоги, возникшие в результате полногеномных дупликаций, а паралоги — это более общий термин, обозначающий копии генов, возникшие в результате любых дупликаций. У современных позвоночных для каждого гена, имеющего соответствующий (ортологичный) ген в геноме ланцетника, ожидается наличие в геноме от 1 до 4 онологов. Вероятность сохранения или утраты копий после дупликации тесно связана с многофункциональностью предкового гена. Если у гена было много функций, то выше вероятность, что его копии после дупликации не будут потеряны за ненадобностью, а приобретут самостоятельную ценность, поделив между собой исходные функции или приобретя новые. Ведь многофункциональность указывает на то, что данный ген в принципе способен приобретать новые функции. Особенно легко новые функции приобретаются регуляторными генами, например, факторами транскрипции, которые по существу являются «профессиональными переключателями», которым всё равно, экспрессию каких генов регулировать. Поэтому можно ожидать, что у позвоночных сохранилось больше онологов тех генов, которые исходно были многофункциональными, в том числе генов с регуляторными функциями, и что у таких онологов могла сильно измениться система регуляции их собственной активности по сравнению с предковым состоянием.
Эти ожидания в целом подтвердились. Оказалось, что чем больше онологов исходного гена сохранилось у позвоночных, тем, во-первых, сложнее регуляция этого гена у ланцетника (сложность регуляции, измеряемая в данном случае числом регуляторных элементов, указывает на многофункциональность гена), во-вторых, тем сложнее в среднем регуляция его онологов у позвоночных (рис. 4, b). Кроме того, чем больше онологов сохранилось, тем сильнее разброс между онологами по сложности регуляции (рис. 4, с). Иными словами, если у позвоночных сохранилось несколько онологов одного и того же предкового гена, то с большой вероятностью одни из этих онологов приобретут очень сложную систему регуляции, а другие — простую. Это, по-видимому, указывает на расхождение функций сохранившихся онологов. Что логично, поскольку если бы функции онологов остались одинаковыми, то такие онологи с большой вероятностью оказались бы избыточными, и отбор не стал бы защищать их от мутационной деградации, так что они в итоге были бы утрачены.
Закономерности, отображенные на рис. 4, справедливы для всех стадий развития ланцетника и данио. То же самое получается и при сравнении ланцетника с другой рыбой (японской оризией) и мышью.
Весьма показательным является то обстоятельство, что вероятность сохранения онологов резко повышена у регуляторных генов, предположительно участвующих в регуляции развития (так называемых “trans-dev” или TD-генов, от слов transcription и development: к этой группе относят регуляторы транскрипции и прочие гены, о которых известно, что их работа как-то связана с регуляцией развития). На это указывают цифры, приведенные в верхней части рис. 4, b. Среди генов с единственной сохранившейся у позвоночных копией TD-гены составляют лишь 1,77%. Среди генов с двумя сохранившимися онологами доля TD-генов выше (6,57%), с тремя или четырьмя — еще выше (соответственно, 12,31 и 14,84%).
Всё это прекрасно согласуется с давно обсуждаемой идеей о том, что позвоночные использовали дополнительную «эволюционную свободу», полученную благодаря полногеномным дупликациям, для усложнения и диверсификации генетических систем, управляющих индивидуальным развитием. Это многом объясняет как сложность, так и разнообразие строения позвоночных. Вероятно, еще до дупликаций многие TD-гены у ланцетникоподобных предков позвоночных были многофункциональными. Возможно, многие из них находились в состоянии «адаптивного конфликта», то есть не могли оптимизироваться для выполнения сразу всех функций с максимальной эффективностью. Полногеномные дупликации сняли эти ограничения и позволили онологам поделить между собой функции, по-разному оптимизировав свои регуляторные и белок-кодирующие участки.
Интересные дополнительные факты о судьбе онологов дал анализ, результаты которого показаны на рис. 5. Оказалось, что в большинстве семейств онологов (семейство включает онологи, происходящие от одного и того же предкового гена) одни онологи сохранили все исходные области экспрессии (то есть продолжили работать везде, где работал предковый ген), а другие «специализировались», продолжив работать только в некоторых из исходных областей.
Рис. 5. Три варианта дальнейшей судьбы онологов после дупликации: «избыточность», «субфункционализация» и «специализация». Рассматривались гены ланцетника и произошедшие от них группы онологов, которые экспрессируются и у ланцетника, и у данного представителя позвоночных (мышь, лягушка или рыба) в каждом из девяти «доменов» (в яйце, в развивающемся эмбрионе, в семенниках, яичниках, коже, кишечнике, печени, мышцах и нервной системе). Если все онологи (которых на самом деле может быть от 2 до 4, но на схеме для простоты показан случай с двумя онологами), как и предковый ген, экспрессируются во всех девяти доменах, это классифицируется как «избыточность» (redundancy). Если каждый из онологов потерял часть предковых областей экспрессии — это «субфункионализация». Наконец, случаи, когда одни онологи сохранили все предковые области экспрессии, а другие — только часть, классифицируются как «специализация». Диаграмма справа показывает, что самый распространенный вариант — это специализация, причем такой вывод получается при сравнении ланцетника и с мышью, и с лягушкой, и с рыбой.
Онологи, претерпевшие самую сильную специализацию (у которых осталось не более двух областей экспрессии из исходных девяти, см. рис. 5), чаще всего экспрессируются в нервной системе. Такие онологи, как правило, не работают в новых типах тканей, появившихся у позвоночных после их отделения от предков ланцетника. Кроме того, для этих «сильно специализированных» онологов характерен самый высокий темп эволюции белок-кодирующей части гена (рис. 6, левый график). Это может означать, что белок оптимизировался для выполнения своих старых функций в тех доменах, где он продолжает работать, или приобрел новые функции. Так или иначе, логично предположить, что чем меньше число областей, где данный ген работает, тем выше вероятность, что случайная мутация, изменившая кодируемый белок, не принесет большого вреда или даже пойдет на пользу. Иными словами, специализация гена может снять часть ограничений, тормозящих его эволюционные изменения.
Рис. 6. У онологов из семейств, претерпевших специализацию (см. рис. 5), наблюдается положительная связь между степенью специализации (числом утраченных областей экспрессии; эта величина отложена по горизонтальной оси на обоих графиках), скоростью эволюции белок-кодирующей части гена (dN/dS, левый график) и сложностью системы регуляции, которая оценивается по числу регуляторных элементов (Number of APREs, правый график).
Обнаружилась также положительная связь между степенью специализации онологов и числом имеющихся у них регуляторных элементов (рис. 6, правый график). По мнению авторов, это означает, что специализация онологов после полногеномных дупликаций шла в основном не путем банальной потери предковых тканеспецифичных энхансеров (то есть своего рода дегенерации), а скорее за счет комплексной перестройки всей системы регуляции гена, в ходе которой возникали новые тканеспецифичные энхансеры (то есть происходило усложнение регуляции специализированных генов).
Таким образом, благодаря полногеномным дупликациям позвоночные приобрели широкий репертуар сложно регулируемых, специализированных генов. Скорее всего, это напрямую связано с усложнением морфологии и дальнейшей прогрессивной эволюцией позвоночных.
Сравнив эту статью с опубликованным 10 лет назад отчетом о прочтении генома флоридского ланцетника, можно увидеть, как далеко продвинулась сравнительная геномика всего за одно десятилетие. Если раньше дело, как правило, ограничивалось сравнением нуклеотидных последовательностей, то сейчас геномы подвергаются всестороннему функциональному анализу с применением методов, которых 10 лет назад просто не существовало. В результате мы получаем всё более глубокое понимание механизмов эволюции и связи генотипа и фенотипа.
Источник: ЭЛЕМЕНТЫ БОЛЬШОЙ НАУКИ
