Метод редактирования генома под названием CRISPR/Cas в современной биотехнологии – одна из самых популярных тем. Вкратце его суть такова: с помощью модифицированных бактериальных ферментов можно внести исправления в определенный участок ДНК, и, в отличие от других редактирующих методов, это можно сделать весьма точно, в том смысле, что молекулярная редактирующая машина сработает только там, куда ее направят. Метод, кроме высокой точности, оказался еще и сравнительно простым, и к тому же универсальным – его можно использовать абсолютно на любом участке генома.
Структура бактериального белка Cas из противовирусной системы CRISPR-Cas; оранжевым обозначена ДНК, с которой связался редактирующий фермент.
Естественно, тут очень скоро заговорили про революцию в биомедицине – ведь с таким инструментом мы вскоре сможем исправлять любые генетические дефекты. Много шума наделала двухлетней давности статья китайских исследователей, которые с помощью CRISPR отредактировали геном человеческого эмбриона, и все больше появляется работ, авторы которых описывают, как им удалось исправить тот или иной мутантный ген либо в культуре клеток, либо в зародыше животного.
Но в последнее время как раз к точности CRISPR/Cas возникает все больше вопросов. Около года назад мы писали про статью в Nature Methods: в ней говорилось о том, что после молекулярной машины CRISPR/Cas в геноме можно найти более полутора тысяч разнообразных мутаций – это и замены одной генетической «буквы»-нуклеотида на другую, и лишние вставки небольших фрагментов ДНК, и лишние удаления фрагментов ДНК. Правда, в случае той работы оказалось все в итоге не так: ее авторы приписали редактирующему методу те мутации, в которых он вовсе не виноват. Но вот сейчас в Nature Biotechnology появилась другая статья на ту же тему – что CRISPR/Cas позволяет себе в геноме много лишнего.
На сей раз исследователи из Института Сенгера сосредоточились не на небольших изменениях, а на крупных перестройках в молекуле ДНК. Чтобы понять, как это может происходить, нужно хотя бы приблизительно представить, как работает CRISPR/Cas. Сам молекулярный аппарат представляет собой сложный комплекс из белков и нуклеиновых кислот. Белок, который разрезает клеточную ДНК в нужном месте, снабжают специально синтезированной нуклеиновой кислотой – последовательность нуклеотидов в ней служит адресом, в соответствии с которым фермент ищет это самое нужное место.
Почувствовав, что ее ДНК повреждена, клетка пытается ее отремонтировать: к месту разреза приходят специальные белки, которые должны его зашить, причем такие белки в силу своих особенностей перед тем, как зашивать, еще увеличивают разрыв. Но зашивают они разрез в соответствии с шаблоном. Такой шаблон в виде еще одного куска нуклеиновой кислоты входит в состав комплекса CRISPR/Cas. Понятно, что образец синтезирован так, как это нужно нам: если нужно внести мутацию, то в шаблоне будет мутация, которую ремонтные белки воспроизведут, когда будут зашивать разрыв; если нужно, наоборот, избавиться от мутации, то шаблон будет нормальным.
Как оказалось, рядом с теми местами, где поработала CRISPR/Cas, выпадают большие куски ДНК - делеции. То есть в том месте, где нужно было что-то отредактировать, все отредактировано, но поблизости может исчезнуть текст в несколько тысяч пар оснований. И либо он просто исчезает, либо же здесь появляется заплатка с последовательностью, скопированной из какого-то другого места в геноме.
Вероятно, какие-то особенности работы CRISPR/Cas побуждают собственные ремонтные системы клетки выедать слишком большие куски в месте ДНК, и потом использовать какие-то образцы из далеких участков ДНК, чтобы залатать эти большие бреши. Авторы работы обнаружили такие крупные перестройки в клетках человека и в двух видах клеток мыши; никаких последствий, ни хороших, ни плохих, для клеток вроде не случилось, но гарантий безопасности здесь все равно мало.
Стоит отметить, что у CRISPR/Cas много модификаций, и среди них есть и такие, где ДНК никто не режет – принцип работы метода там несколько иной. Тем не менее, очевидно, что поведение CRISPR/Cas все еще требует всесторонних исследований, без которых пускать его в клинику было бы неоправданным риском.
Источник: НАУКА И ЖИЗНЬ
