Китайские ученые при помощи системы CRISPR-Cas9 выключили ген в эмбрионах макак-резусов, вырастили из этих эмбрионов детенышей, а затем провели полногеномное секвенирование нескольких троек мать-отец-детеныш. По утверждению исследователей, у обезьян с отредактированным геномом количество новых мутаций не превышает естественный уровень мутагенеза. Это означает, что CRISPR-Cas9 в действительности не вносит в геном значительного количества нецелевых мутаций, как сообщалось ранее. Препринт статьи доступен на BioRxiv.
Возможность применения бактериальной системы CRISPR-Cas для редактирования генома млекопитающих показали только в 2012 году, однако с тех пор ее многократно опробовали на животных, различных клеточных линиях и даже человеческих эмбрионах. Использование этой системы позволяет увеличить эффективность выключения отдельных генов и исправления мутаций, что может быть использовано для лечения наследственных заболеваний или терапии рака. Действие системы основано на том, что фермент-нуклеаза Cas9 узнает и разрезает последовательность ДНК, на которую ему «указывает» короткая РНК-затравка (направляющая РНК).
Применение CRISPR-Cas9 на людях ограничено несколькими опасениями. Одно из них — недостаточная точность внесения разреза, которая может привести к появлению в геноме множества нецелевых мутаций. Ученые из научных центров Куньмина, Пекина и Шанхая проверили последствия CRISPR-редактирования генома обезьян, о чем сообщили в препринте статьи на BioRxiv.
В оплодотворенные зиготы макак-резусов ввели мРНК Cas9 и направляющую РНК против гена микроцефалина MCPH1, мутации в котором приводят к микроцефалии плода. Как показала проверка, выключение гена в эмбрионах происходило с эффективностью 86 процентов. Чтобы вырастить отредактированных животных, эмбрионы после инъекции Cas9 подсадили суррогатным матерям, и из 30 зигот удалось получить пять детенышей, один из которых родился мертвым.
Первичная проверка показала, что эффективность редактирования составила 80 процентов (четыре из пяти), но при этом все отредактированные животные оказались мозаиками, то есть часть их клеток содержала мутацию, а часть нет. У всех пяти животных, включая мертвое, а также у троих их родителей отсеквенировали геномы с целью подсчета количества новых мутаций у детей по сравнению с родителями.
На первой стадии полногеномного анализа исследователи проверили участки ДНК отредактированных обезьян, куда, по предсказанию специальных программ, могла бы неспецифически привлекаться РНК-затравка — именно в этих местах стоит ожидать возникновения лишних мутаций. Оказалось, что из четырех с лишним тысяч таких участков мутаций не возникло ни в одном.
Отбор новых мутаций (замен и инсерций-делеций) при помощи фильтрации вариантов четырьмя разными программами для аннотации в геноме одной особи
На втором этапе ученые сравнили геномы отредактированных животных с ДНК их родителей и составили список мутаций, которые появились de novo и потенциально могли быть привнесены белком Cas9. Оказалось, что с высокой достоверностью геном каждого отредактированного детеныша содержит в среднем 32 новых мутации (30 замен и две делеции или инсерции). При этом уровень спонтанного мутагенеза у обезьян, по разным оценкам, составляет от 22 до 78 новых мутаций в поколение. Авторы работы, таким образом, сделали вывод, что Cas9 не вносит заметного количества нецелевых мутаций в ДНК.
В работе исследователи также использовали данные коллег, которые ранее встроили в геном эмбрионов макак зеленый флуоресцентный белок при помощи CRISPR-Cas9 и генотипировали животных по потенциальным неспецифическим сайтам для Cas9. Эти данные также показали отсутствие лишних мутаций.
Источник: N+1
