Американские ученые удачно скомбинировали несколько известных технологий и получили новый подход к исследованию отдельных клеток живых тканей. Они применили его для анализа предракового состояния молочной железы (карциномы протоков in situ) и его перехода в рак (инвазивную дуктальную карциному). Исследование 1293 клеток от 10 больных показало, что основные мутации накапливаются уже в предраковом состоянии. Разработанный подход может быть использован для детального исследования эволюции клеток других и типов рака.
Рак молочной железы — самое распространенное онкологическое заболевание у женщин. Примерно у 10% женщин рано или поздно развивается рак этого типа. У мужчин он тоже встречается, но очень редко. Чаще всего рак молочной железы — это результат злокачественного перерождения клеток протоков молочной железы (дуктальная карцинома) или долей, в которых вырабатывается молоко (лобулярная карцинома), а всего известно18 форм этого рака.
Рак молочной железы больше распространен в развитых странах. Это связано, в частности, с характерным для таких стран небольшим числом детей в семьях, сокращением периода грудного вскармливания новорожденных (или отказом от него), увеличением продолжительности жизни (вероятность заболевания у женщин после 65 лет, например, в 5,8 раз выше, чем до 65 лет, и почти в 150 раз выше, чем до 30 лет). По данным ВОЗ в мире ежегодно регистрируется более 1,5 миллионов новых случаев заболевания раком молочной железы и более 500 тысяч смертей от него. При этом современная медицина уже относительно неплохо умеет с ним справляться: в развитых странах смертность от этого рака в течение 5 лет после постановки диагноза не превышает 10–20% (в более бедных странах, к сожалению, смертность существенно выше). Но исследования продолжаются.
Рис. 1. Эволюция отдельных клеток при развитии рака молочной железы. Неинвазивная карцинома протоков молочной железы in situ (DCIS) происходит от единственной клетки и ее потомков. В некоторых их этих клеток возникают мутации, в дальнейшем они формируют разные популяции (клоны, обозначенные красным, желтым и лиловым). DCIS может превратиться в инвазивную карциному протоков молочной железы (IDC). Авторы обсуждаемого исследования установили, что IDC может происходить из разных клонов клеток DCIS.
Самая частая (на нее приходится около 80% всех случаев) и хорошо изученная форма рака молочной железы — дуктальная карцинома. Очень часто, хотя и не всегда, раку предшествует карцинома протоков молочной железы in situ (ductal carcinoma in situ, DCIS), которая считается или предраковым состоянием, или ранней стадией рака. Она обычно обнаруживается при маммографии — стандартной процедуре обследования молочной железы. Предраковым состоянием DCIS называют потому, что она представляет собой кластер злокачественных клеток, которые не склонны к инвазии в соседние ткани.
С вероятностью 10–30% DCIS превращается в истинный рак, инвазивную карциному протоков (invasive ductal carcinoma, IDC), клетки которой уже могут прорастать в окружающие ткани и образовывать метастазы. DCIS может пребывать в латентном состоянии много лет. Точно предсказать ее пробуждение и превращение в инвазивную карциному невозможно, поэтому больным рекомендуется превентивная хирургическая операция с последующей лучевой терапией.
Ранее предлагались два сценария этого превращения (рис. 2). Согласно первому сценарию, DCIS и IDC параллельно развиваются из нормальных клеток, которые независимо друг от друга превращаются в злокачественные с разными свойствами. Этот сценарий подкрепляется исследованиями, в которых были обнаружены разные молекулярные маркеры у DCIS и IDC (см., например, A. Miron et al., 2010. PIK3CA Mutations in In situ and Invasive Breast Carcinomas). Согласно второму сценарию, в DCIS формируются разные популяции клонов злокачественных клеток, но лишь одна из них проходит через «бутылочное горлышко» — преодолевает базальную мембрану и дает начало IDC (C. F. Cowell et al., 2013. Progression from ductal carcinoma in situ to invasive breast cancer: Revisited). В пользу этого сценария говорят геномные исследования, выявившие одинаковые мутации в клетках DCIS и IDC. Но до сих пор оставалось неясным, как именно происходит превращение карциномы протоков in situ в инвазивную карциному. Ученые из Онкологического центра им. М. Д. Андерсона попробовали в этом разобраться.
Рис. 2. Три сценария перехода неинвазивной карциномы in situ (DCIS) в инвазивную (IDC) при раке молочной железы. A — независимое происхождение DCIS и IDC параллельно из разных малигнизированных исходных клеток (N1 и N2 — нормальные клетки, превратившиеся в раковые). B — модель эволюционного «бутылочного горлышка»: разные клетки протока молочной железы образуют эволюционирующие популяции клонов, но только них только один из них может преодолеть базальную мембрану и дать начало инвазивной карциноме. C — мультиклональная инвазия: эволюция геномов нездоровых клеток происходит внутри протока молочной железы, в результате образуется несколько клонов, способных дать начало инвазивной карциноме.
В DCIS содержится сравнительно мало клеток, а IDC гетерогенна (то есть ее мутации в ее клетках слишком разонородны), поэтому известные методы для сравнения свойств DCIS и IDC не годились. Авторы обсуждаемой работы модифицировали, усовершенствовали и свели воедино ряд уже известных методов. В результате получился новый подход, названный топографическим секвенированием отдельных клеток (Topographic Single Cell Sequencing, TSCS). С его помощью удалось проследить, какие изменения происходят в геномах отдельных клеток при возникновении DCIS из нормальных и при превращении DCIS в IDC.
Ученые брали образцы ткани у пациентов с DCIS и IDC и на гистологических срезах определяли локализацию клеток этих заболеваний по морфологическим отличиям от нормальных клеток. Также определялись области с нормальной тканью. Далее из этих участков лазером вырезали отдельные клетки и с помощью лазера же перемещали их в отдельные пробирки (рис. 3). Это позволило свести к минимуму вероятность загрязнения посторонним материалом. После этого ученые приступили к геномным исследованиям. Клетки лизировали и амплифицировали их ДНК с помощью полимеразной цепной реакции с «вырожденными» праймерами (degenerate oligonucleotide primed PCR).
Рис. 3. Схема топографического секвенирования отдельных клеток. A — срез ткани, окрашенный гематоксилин-эозином. B, С — вырезание отдельных клеток лазером и перенос их в пробирки. D — подготовка клеток к полногеномному исследованию (WHA).
Полученный материал анализировали методами высокоэффективного секвенирования нового поколения. Так были охарактеризованы 1293 опухолевые клетки, полученные от 10 больных раком молочной железы. Высокоэффективное секвенирование позволяет не только определить последовательность нуклеотидов ДНК, но и оценить количество копий разных участков ДНК в геноме. В результате выявилось, что и в клетках DCIS, и в клетках IDC клетках есть существенная вариация числа копий генов (рис. 4).
Рис. 4. Вверху — пример распределения по геному аномального числа копий различных участков ДНК клеток IDC (invasive) и DCIS (in situ) по сравнению с нормальными клетками. Внизу — аномальное распределение копий участков генома в трех клонах раковых клеток одной из больных и локализация некоторых генов, связанных с инициацией и прогрессией рака. Цифры в верхнем ряду обозначают номера хромосом.
Утрата или амплификация разных участков генома, в общем, свойственны раковым клеткам. Авторы воспользовались этим и, сравнивая профили вариации числа копий генов, проследили переход от нормальных клеток к DCIS и к IDC. Этому способствовало то, что многие из участков генома, у которых наблюдалось изменение количества копий, связаны с формированием и прогрессией опухолей.
У четырех больных IDC оказались потомками одного клона клеток DCIS, а у других шести — потомками нескольких (от двух до пяти) разных клонов клеток DCIS. Но во всех случаях клетки и DCIS, и IDC происходили от единственной родительской нормальной клетки (рис. 1), а дальнейшие аномалии генома в различных клонах накапливались вследствие генетической дивергенции. Полученные результаты представляются достоверными, поскольку было исследовано более тысячи индивидуальных клеток от 10 больных.
Затем, чтобы сравнить наборы точечных «раковых» мутаций, авторы провели детальное секвенирование участков геномов, кодирующих белки. И в DCIS-, и в IDC-клетках было найдено в среднем по 23 мутации, которые могут иметь отношение к инициации и прогрессии раковых опухолей. В частности, мутации обнаруживались в генах TP53, PIK3CA, NCOA2, ABL2, PDE4DIP, AHNAK, RUNX1. Но в IDC-клетках не наблюдалось статистически достоверного накопления новых мутаций по сравнению с DCIS. Следовательно, практически вся «злокачественность» возникла уже при формировании DCIS.
Таким образом, авторы разработали новый комплексный подход для секвенирования ДНК из отдельных клеток и применили его для анализа эволюции генома раковых клеток на ранних стадиях развития рака молочной железы. Оказалось, что основные события эволюции — перестройки генома клетки и накопление свойственных раку мутаций — происходят уже при формировании предракового состояния (DCIS), то есть до того, как клетки приобретут способность к инвазивному росту (и разовьется собственно рак, инвазивная карцинома протоков — IDC). Все клоны и предраковых, и раковых клеток происходят, по всей видимости, из единственной нормальной родительской клетки. Приобрести способность к инвазивному росту могут как один, так и несколько клонов клеток DCIS. Эта модель, названная «мультиклональная инвазия» существенно отличается от ранее предложенных моделей независимой эволюции и эволюционного «бутылочного горлышка».
Тем не менее остаются нерешенными важные проблемы. Пока нет ответа на главный вопрос: что инициирует переход вроде бы безобидного предракового состояния (DCIS) в агрессивную карциному IDC? Поскольку этот переход происходит не всегда, то, может быть, есть две формы DCIS: с низким и высоким риском трансфомации в IDC. Нужно будет определить тонкие различия между ними. Возможно, их удастся найти на уровне экспрессии определенных генов или на уровне эпигенетических отличий в хроматине, например, метилирования ДНК или гистонов, влияющих на экспрессию определенных генов. А подход, предложенный американскими онкологами в обсуждаемой работе, должен помочь не только в дальнейших исследованиях по этой теме, но может быть с успехом применен для исследования клеток и их эволюции при других онкологических заболеваниях — неслучайно эта ювелирно выполненная работа опубликована в самом авторитетном журнале по молекулярной биологии.
Источник: ЭЛЕМЕНТЫ БОЛЬШОЙ НАУКИ
