Российские исследователи разработали новый способ мечения реплицирующейся ДНК, при помощи которого можно наблюдать за делением и дифференциацией стволовых клеток практически в любых тканях. Метод, описанный в публикации в журнале Stem Cell Reports, основан на применении трех модифицированных аналогов нуклеотидов, которые включаются в новосинтезированную ДНК вместо тимидина. Последовательное окрашивание трех разных меток в мозге позволило исследователям наблюдать за нейрогенезом у мышей.
Клетки кишечника: голубым, зеленым и красным обозначены три разные метки, введенные с интервалом в 24 часа.
Стволовые клетки, в отличие от большинства дифференцированных клеток тканей, постоянно делятся. Этот процесс удобно отслеживать по накоплению новых цепочек ДНК, которые синтезируются в S-фазе клеточного цикла. В середине XX века для этого начали использовать радиоактивно меченный тимидин (один из четырех нуклеозидов, входящих в состав ДНК), а позднее исследователи разработали ряд галогенированных аналогов тимидина, которые можно детектировать при помощи антител — это позволило использовать две разных метки и следить за разными популяциями клеток одновременно.
Сотрудники МФТИ и университета Стоуни-Брука в США под руководством Григория Ениколопова разработали способ, позволяющий использовать одновременно три или даже четыре метки. Для этого ученые использовали одновременно три разновидности нуклеотидов, два из которых можно детектировать при помощи антител, а третий — при помощи присоединения флуоресцентного красителя. Благодаря дополнительной стадии обработки клеток авторам работы удалось избавиться от неспецифичного связывания красителя и антител, что значительно увеличило разрешение и точность метода.
Метки вводили в мозг живым мышам с интервалом в два часа, после чего животных умерщвляли и анализировали срезы мозга, в частности, зоны гиппокампа и желудочков мозга, в которых происходит нейрогенез. Исследователям удалось не просто детектировать стволовые клетки мозга, но и установить некоторые количественные параметры их клеточного цикла, например, измерить продолжительность S-фазы. Также авторы продемонстрировали возможность наблюдать за субпопуляциями стволовых клеток в тканях мозга, кишечника и семенников.
Зубчатая извилина гиппокампа, помеченная тремя различными метками (слева). Справа - та же структура в флуоресцентном канале, соответствующем зеленому флуоресцентному белку, который экспрессируют клетки
По словам старшего научного сотрудника лаборатории стволовых клеток мозга МФТИ Олега Подгорного, тройная метка главным образом используется в лаборатории для анализа различных воздействий на процессы нейрогенеза у мышей. Среди этих факторов, например, радиация, противоопухолевые препараты и лекарства, применяемые при заболеваниях нервной системы, в том числе, болезни Альцгеймера.
Источник: N+1
