Исследователям удалось получить индуцированные плюрипотентные стволовые клетки из дифференцированных клеток соединительной ткани путем введения в них искусственного активатора транскрипции на основе белка Cas9. Для превращения «взрослых» клеток в стволовые оказалось достаточно активировать единственный «фактор Яманаки» — Sox2, либо Oct4. Исследование опубликовано в журнале Cell Stem Cell.
Стволовые клетки мыши
Стволовые плюрипотентные клетки весьма востребованы в медицине — из них можно получить много разных видов клеток, например, нейроны, кардиомиоциты или клетки сетчатки, которые в дальнейшем можно использовать для трансплантации в больной орган. Кроме того, сами стволовые клетки тоже используются для трансплантации — к примеру, мы рассказывали, как трансплантация индуцированных стволовых клеток вылечила мышей от глаукомы, а инъекция стволовых клеток в мозг людей, пострадавших от инсульта, значительно улучшила состояние пациентов.
В 2012 году Нобелевская премия по физиологии и медицине была присуждена японскому ученому Шинья Яманаке за разработку технологии превращения дифференцированных клеток обратно в стволовые — так называемые индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC). Оказалось, что для этого необходимо экспрессировать в клетках четыре белка — фактора транскрипции Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc, которые условно называют «факторами Яманаки».
Исследователи из Институтов Гладстона в США и университета Цинхуа в Китае использовали для искусственного повышения экспрессии этих факторов систему CRISPR-активации на базе модифицированного неактивного белка Cas9 (dCas9). В этой системе dCas9 используется не для редактирования, так как лишен нуклеазной активности, а как «средство доставки» активаторных или репрессорных белков к конкретному участку генома для управления экспрессией генов.
В своей работе ученые использовали в качестве искусственного активатора разработанную несколькими годами ранее конструкцию dCas9-SunTag-VP64, которая обеспечивает привлечение к регуляторному участку гена сразу множества активаторных доменов VP64 и таким образом, обеспечивает высокий уровень экспрессии выбранного гена.
Схема работы искусственного активатора dCas9-SunTag-VP64. Белок привлекается к промотору нужного гена при помощи гидовой РНК (sgRNA), и активирует транскрипцию гена
Сначала исследователи использовали конструкцию для одновременной активации в мышиных эмбриональных фибробластах (дифференцированных клетках соединительной ткани) двух «факторов Яманаки» и трех других «стволовых» факторов, и убедились, что в клетках происходит ремоделирование генома и активация генов, характерных для стволовых клеток. Маркерами плюрипотентного состояния клеток служила повышенная экспрессия панели генов, в том числе Oct4, Sox2, Nanog, Esrrb, Nr5a2 и Utf1.
Далее исследователи стали активировать факторы по одному, и обнаружили, что высокий уровень активации единственного гена Sox2, который достигался привлечением к одному из его регуляторных участков (промотор S-17) dCas9, обеспечивает индукцию в плюрипотентные стволовые клетки как мышиных эмбриональных фибробластов, так и фибробластов, выделенных из кожи взрослой мыши. Полученные таким образом стволовые клетки сохраняли свои свойства как минимум в течение 20 пересевов. Активация фактора Oct4 также привела к превращению мышиных фибробластов в стволовые клетки. Для этого оказалось необходимо направить dCas9 не только к промотору гена, но и к удаленному регуляторному участку (энхансеру).
Несмотря на то, что CRISPR-активация уже использовалась для индукции экспрессии генов Sox2 и Oct4, при помощи этого подхода получить индуцированные плюрипотентные стволовые клетки еще не удавалось.
Источник: N+1
