При помощи искусственной третьей пары оснований в ДНК ученые смогли закодировать аминокислоту, расширив тем самым природный генетический код. Ранее та же исследовательская группа встроила третью пару оснований X-Y в ДНК бактерий и, таким образом, создала первый полусинтетический живой организм. В новой работе, опубликованной в Nature, бактерий научили не просто воспроизводить искусственную ДНК, но и реализовывать закодированную в ней информацию в виде белка.
Бактерии, синтезирующие зеленый флуоресцентный белок
Эксперименты с кишечной палочкой с расширенным генетическим алфавитом проводит группа под руководством Флойда Ромесберга из Исследовательского института Скриппса в Калифорнии. В нашей заметке вы можете прочитать, как ученые из лаборатории Ромесберга создали полусинтетических бактерий, способных стабильно воспроизводить (реплицировать) ДНК, содержащую помимо «природных» пар нуклеотидов A-T и G-C, лишнюю пару X-Y. Под X здесь скрывается синтетический дезоксинуклеозид dNaM, а под Y — dTPT3. Так как самостоятельно синтезировать дополнительные основания бактерии неспособны, X и Y в виде трифосфатов приходится добавлять в ростовую среду. Чтобы вещества попали в клетку, в геном бактерий ученые встроили ген транспортера из генома водоросли Phaeodactylum tricornutum.
Чтобы полусинтетическая ДНК могла копироваться и передаваться из поколения в поколение, лишние основания должна узнавать ДНК-полимераза. Но чтобы при помощи такой ДНК можно было закодировать белок (собственно, это основная функция ДНК), необходимо адаптировать к синтетическим молекулам гораздо более громоздкий аппарат трансляции. В новой работе ученым удалось это сделать.
Реализация наследственной информации происходит в клетке в несколько этапов. Сначала с ДНК считывается молекула матричной РНК (мРНК), которая служит «инструкцией» для рибосомы в процессе синтеза белка. Последовательность аминокислот закодирована в мРНК в виде последовательности трехбуквенных кодонов. Соответствие кодона и аминокислоты обеспечивает транспортная РНК (тРНК), которая содержит в себе антикодон, комплементарный кодону в мРНК. За правильное присоединение аминокислоты к тРНК отвечает фермент аминоацил-тРНК-синтетаза. Молекула тРНК, «заряженная» нужной аминокислотой, доставляет последнюю на рибосому, где аминокислота включается в белковую цепочку в нужном месте благодаря соответствию кодон-антикодон.
Синтез белка
Чтобы продемонстрировать способность полусинтетической ДНК кодировать информацию, ученые ввели искусственное основание в ген зеленого флуоресцентного белка (GFP). Тирозин (TAC) в позиции 151 было решено заменить на серин, но вместо кодона AGC в ген встроили кодон AXC. Серин был выбран по той причине, что его аминоацил-тРНК-синтетаза имеет широкую специфичность — в таблице генетического кода этой аминокислоте соответствуют шесть кодонов. Чтобы обеспечить соответствие кодон-антикодон, в ген для тРНК серина ввели последовательность GYT. Синтезировать мРНК гена GFP и тРНК серина должна была РНК-полимераза бактериофага T7.
Сверху изображена искусственная пара оснований dNaM-dTPT3 (dX-dY), комплементарность в которой обеспечивается за счет гидрофобных взаимодействий, а не за счет водородных связей, как в канонической паре dA-dT. Внизу представлена схема генетической конструкции, содержащей искусственные основания в составе гена зеленого флуоресцентного белка (sfGFP) и тРНК серина (serT)
Чтобы в клетке могла синтезироваться полусинтетическая РНК, в ростовую среду пришлось добавить также рибонуклеозидфосфаты NaM и TPT3. Оказалось, что транспортер из водоросли может закачивать их в клетку, а вирусная РНК-полимераза эффективно встраивает новые «буквы» в РНК. Сериновая аминоацил-тРНК-синтетаза успешно присоединила серин к модифицированной тРНК, и аминокислота встроилась в белок, что стало понятно по зеленому свечению клеток. Если мутантного гена для тРНК не было, свечения тоже не было, так как синтез останавливался на 151 позиции.
На втором этапе ученые присвоили искусственному кодону отдельную, неканоническую (то есть не входящую в двадцатку самых распространенных) аминокислоту. Для этого в «подопытную» кишечную палочку дополнительно ввели гены тРНК и соответствующей аминоацил-тРНК-синтетазы для пирролизина из микроорганизма Methanosarcina barkeri. Включение пирролизина в белок детектировали в первую очередь по свечению бактерий, которое достигло почти 70 процентов от свечения клеток с «натуральным» белком. Включение аминокислоты также детектировали по специфическому присоединению к остатку пирролизина флуоресцентного красителя в составе очищенного белка.
Помимо кодона AXC исследователи протестировали кодон GXC и соответствующий ему антикодон GYC, которые также успешно сработали для пирролизина. Таким образом, природный генетический код удалось расширить сразу на две позиции.
Эффективность встраивания пирролизина (PrK) в белок в позиции 151, закодированного кодоном AXC либо GXC, по сравнению с тирозином (Y), который стоит в этой позиции в белке дикого типа. Видно, что с небольшой вероятностью (1-2 процента) вместо пирролизина могут встраиваться другие аминокислоты, например изолейцин (I) или валин (V), что обусловлено неправильным встраиванием основания напротив X при репликации
Никакого практического применения у этой работы пока нет — ученые просто «играют в богов» и экспериментируют с возможностями генетического аппарата живых организмов. В отличие от Крейга Вентера, который заявлял о создании синтетического организма, подразумевая микоплазму с «урезанным» геномом, группа Ромесберга на деле гораздо ближе к созданию «синтетической жизни». Впрочем, помимо синтетических бактерий, его лаборатория занимается и более прикладными вещами — к примеру, мы писали о геле из модифицированной ДНК, который можно использовать для длительного хранения белков. Также сотрудники лаборатории занимаются разработкой новых антибиотиков. Для введения результатов исследований в практику Ромесбергом была создана биотехнологическая компания Synthorx.
Источник: N+1
