Внеклеточные везикулы — это разнородная группа небольших мембранных пузырьков, окруженных липидной мембраной и содержащих в себе липиды, белки и РНК. Многие годы ученые считали, что при помощи везикул клетки избавляются от внутриклеточного мусора, и только открытия последних лет позволили оценить потенциал внеклеточных везикул как важных переносчиков информации между клетками и как средства для обнаружения различных заболеваний. Но среди ученых нет единогласия ни по поводу оптимального протокола для выделения внеклеточных везикул, ни по поводу их состава. Новая работа американских ученых, среди которых и Нобелевский лауреат Рэнди Шекман, имеет все шансы заложить фундамент для понимания того, какие именно РНК входят в состав внеклеточных везикул и как эти РНК туда попадают.
Рис. 1. Фотографии экзосом (субпопуляция внеклеточных везикул размером от 30 до 100 нм) после ультрацентрифугирования (слева) и после очистки с помощью градиента сахарозы. Закрашенные треугольники указывают на белковые загрязнения препарата экзосом, а незакрашенный — на внеклеточную везикулу размером больше 100 нм. Отличительная черта экзосом — «чашеобразная» форма. Экзосомы были получены из модельной линии клеток человека HEK293T, которая широко используется для изучения самых разных аспектов клеточной биологии. Фотографии сделаны с помощью электронного микроскопа при увеличении 9300X.
Без постоянного обмена информацией невозможно себе представить координированное сосуществование клеток многоклеточных организмов. Важность такого обмена, происходящего на разных уровнях, сложно переоценить. Он может происходить как за счет непосредственного контакта, так и посредством выделения различных молекул и мембранных образований во внеклеточное пространство. К первым можно отнести, например, факторы роста и гормоны, а ко вторым — внеклеточные везикулы, о которых мы пока знаем очень мало и о которых далее пойдет речь.
Сейчас известно, что внеклеточные везикулы производятся всеми без исключения клетками нашего организма. Это крошечные — размером от 30 до 5000 нм — пузырьки, в которых находятся липиды, белки и РНК. Содержимое этих пузырьков окружено двухслойной липидной оболочкой, которая является производной клеточной мембраны. Первые экспериментальные наблюдения внеклеточных везикул были сделаны еще в 1946 году. Тогда они были обнаружены в качестве тромбоцитарных частиц, способствующих свертыванию крови. Только почти 40 лет спустя удалось понять, как именно образуются эти частицы. В 1983 году при изучении ретикулоцитов было замечено, что похожие частицы формируются в мультивезикулярных тельцах внутри клеток.
Классификация внеклеточных везикул основана на их происхождении (и, косвенно, на размерах). Так, экзосомы (обычно от 30 до 100 нм, рис. 1) образуются как раз в мультивезикулярных тельцах. Микровезикулы (, от 100 до 1000 нм) просто отпочковываются от клеточной мембраны во внеклеточное пространство. Апотельца (более 1000 нм) — это и во вовсе клеточные фрагменты, образовавшиеся в результате апоптоза. На протяжении десятилетий преобладало мнение, что для клеток внеклеточные везикулы — всего лишь способ избавиться от внутриклеточного мусора. Такое отношение постепенно отходит в прошлое. Причина тому — растущее понимание, что липидная мембрана этих пузырьков скрывает от агрессивных ферментов межклеточного пространства (скорее всего) функциональные липиды, белки и РНК.
Несмотря на относительно большой прогресс в изучении внеклеточных везикул, многие вопросы остаются без ответа. Например, не существует надежного способа разделения экзосом, микровезикул и апотелец. Непонятно, как себя ведут внеклеточные везикулы в организме, а не в культурах клеток. Остается загадкой, какой именно из компонентов внеклеточных везикул отвечает за те или иные реакции в клетках, получающих эти везикулы, и какие механизмы при этом задействуются. И всё же главной задачей остается выработка четкого представления о том, какие РНК, а также липидные и белковые молекулы переносятся внеклеточными везикулами и как эти молекулы оказываются внутри везикул.
Нефрагментированные РНК во внеклеточных везикулах
В работе, опубликованной недавно в журнале PNAS, ученые из Калифорнийского университета в Беркли и из Техасского университета в Остине предприняли совместную попытку наиболее тщательно охарактеризовать молекулы РНК из внеклеточных везикул, а также из субпопуляции этих везикул — экзосом, содержащих классический экзосомный маркер — тетраспанин CD63. Казалось бы, что в этом особенного? И правда — ничего (похожие эксперименты проводили и раньше), если не учитывать, каким методом было проведено РНК-секвенирование.
Для начала, что все-таки удалось узнать? Во-первых, — и этот результат согласуется с предыдущими исследованиями — самыми многочисленными оказались короткие некодирующие РНК (62%), рибосомные РНК (рРНК, 27%), и РНК белок-кодирующих генов (мРНК, 6,6%), а на все остальные биотипы пришлось всего 4,4%. Из коротких некодирующих РНК лучше остальных были представлены транспортные РНК (тРНК, 80% коротких РНК) и Y-РНК (14% коротких РНК), тогда как доля микроРНК составила меньше 0,5% от всех секвенированных последовательностей (рис. 2, A). Также оказалось, что биотипы РНК представлены примерно одинаково во внеклеточных везикулах (рис. 2, А) и в их субпопуляции — CD63+-экзосомах (рис. 2, B). По этой причине авторы в дальнейших экспериментах использовали только экзосомы, сконцентрировавшись таким образом на более однородном материале.
Рис. 2. Биотипы РНК, представленные во внеклеточных везикулах (A) и CD63+-экзосомах (B). Слева показаны все обнаруженные биотипы РНК (Total RNA), а справа — биотипы только коротких некодирующих РНК (Small ncRNA). Из этого рисунка видно, что по составу РНК CD63+-экзосомы очень похожи на внеклеточные везикулы. Mt — транскрипты митохондриальных генов, Protein-coding — белок-кодирующие, или матричные РНК (мРНК), Pseudogene — псевдогены, rRNA — рибосомные РНК, Antisense — длинные некодирующие РНК, гены которых перекрываются с другими генами на комплиментарной цепи ДНК (не путать с антисмысловыми РНК!), lincRNA — длинные некодирующие РНК из межгенных участков, sncRNA — короткие некодирующие РНК; tRNA — транспортные РНК, Vault RNA — РНК из органеллы Vault, miRNA — микроРНК, snoRNA — малые ядрышковые РНК, snRNA — малые ядерные РНК, Other snRNA — другие короткие некодирующие РНК. В скобках указано количество генов для каждого биотипа.
Сюрпризом стало то, что большинство секвенированных тРНК и других коротких РНК имели полную длину и вовсе не были фрагментированы, как предполагалось на основе ранее опубликованных данных. Кто-то предполагал, что фрагменты коротких РНК — это продукты деградации или же токсичные продукты метаболизма клеток, кто-то — что это их новые функциональные производные. Оказалось же, что этих фрагментов просто нет во внеклеточных везикулах в сколько-нибудь значимых количествах!
Почему мы узнаем о нефрагментированных РНК во внеклеточных везикулах только сейчас, после многих лет экспериментов? И получается ли, что все остальные ошибались? Очень похоже, что да. Как так вышло? Ответ достаточно прост, но в то же время способен произвести небольшую революцию в подходе к секвенированию РНК, в частности — коротких некодирующих РНК. Авторы обсуждаемой статьи просто задались вопросом: «А что если мы неправильно всё секвенируем?».
Дело вот в чём. Наиболее популярная на данный момент платформа для РНК-секвенирования не использует для секвенирования непосредственно РНК. Вместо нее используется комплементарная ДНК (кДНК), синтезируемая с матрицы РНК ферментом обратной транскриптазой. В свою очередь, обратная транскриптаза имеет один существенный недостаток — она плохо считывает последовательности РНК, которые участвуют в образовании вторичных структур. При повышенных температурах вторичная структура РНК разрушается, но синтезировать кДНК при таких условиях обычные обратные транскриптазы не могут. Нужна не простая, а термостабильная обратная транскриптаза.
Из-за своих маленьких размеров внеклеточные везикулы практически не вмещают длинных РНК. А как назло, короткие РНК (до 200 нуклеотидов в длину), например тРНК , часто обладают очень стабильной вторичной структурой и многочисленными модификациями. Это важно для их участия в транспорте аминокислот к рибосомам, но при этом сильно затрудняет обратную транскрипцию. Обычной обратной транскриптазе такие РНК часто не по силам. Проблему обратной транскрипции РНК со стабильной вторичной структурой удалось решить использованием термостабильной обратной транскриптазы GsI-IIC RT (или thermostable group II intron reverse transcriptase-III, TGIRT-III), а метод РНК-секвенирования назвали TGIRT-seq. Этот метод позволил считывать последовательности РНК от начала до конца, ведь теперь вторичная структура не вызывала прекращение синтеза кДНК.
Несмотря на использование термостабильной обратной транскриптазы, ученые заметили, что группа последовательностей экзосомных тРНК всё же была на 15 нуклеотидов короче тРНК полной длины. Так как считывание РНК при обратной транскрипции идет от конца молекулы к началу, остановка должна была происходить в участке тРНК, называемом D-петлей (D-arm, рис. 3, A). Поскольку синтез кДНК теперь осуществлялся при повышенной температуре, вряд ли проблемой была вторичная структура.
Ученые предположили, что такая остановка может быть результатом модификации основания РНК в данной позиции. Они воспользовались тем, что разные обратные транскриптазы семейства TGIRT отличаются своей способностью читать модифицированные нуклеотиды. Когда они провели синтез кДНК двумя разными TGIRT-ферментами, то один (GsI-IIC RT или TGIRT-III, рис. 3, B), по-прежнему останавливался в 15 нуклеотидах от начала тРНК, тогда как другой (TeI4c RT, рис. 3, С) — нет. Поэтому исследователи пришли к выводу, что в этой позиции у экзосомных тРНК находится нуклеотид с неизвестной модификацией. Этим нуклеотидом мог быть дигидроуридин, что вполне обычно для D-петли тРНК. Против этого говорят два наблюдения: во-первых, известно, что TGIRT-ферменты могут легко считывать дигидроуридин, а во-вторых, остановки за 15 нуклеотидов не было замечено в случае с внутриклеточными тРНК.
Рис. 3. A — структура тРНК, показаны D-, T- и антикодоновая петли; 5’ означает начало молекулы, 3’ — ее конец. Примерное положение нуклеотида с неизвестной модификацией показано красной ломаной линией. B и C — распределение длин последовательностей тРНК после секвенирования РНК c использованием двух термостабильных обратных транскриптаз — GsI-IIC RT (также известной как TGIRT-III) и TeI4c RT. При секвенировании клеточной РНК (Whole cells, голубые графики) все последовательности соответствуют тРНК полной длины (пик Full length) вне зависимости от типа обратной транскриптазы. В то же время, при секвенировании экзосомной РНК (Exosomes, красная линия) GsI-IIC RT останавливается за 15 нуклеотидов до начала тРНК (график B, пик tRNA*), а TeI4c RT — нет (обратная транскрипция происходит от конца молекулы РНК (3’) к ее началу (5’)).
Получается, что только экзосомные тРНК имеют такую модификацию, и это — не дигидроуридин, а что-то совсем новое. Важно подчеркнуть, что этой модификации нет у внутриклеточных РНК. Из этого может следовать, что все тРНК, имеющие такую модификацию автоматически отправляются в экзосомы. При этом авторы не исключают и возможности, что модификация нуклеотида в этой позиции происходит прямо в экзосомах! Является ли данная модификация условием или результатом помещения тРНК в экзосомы — покажут дальнейшие исследования.
На самом деле, ничего удивительного в том, что РНК в экзосомах не фрагментированы нет. Двойной липидный слой надежно защищает экзосомные РНК от всего, что находится во внеклеточном пространстве, включая различные разрушающие РНК ферменты (РНКазы). Интересно, что, если добавить к препарату экзосом немного растворителя, чтобы нарушить целостность их липидных мембран, и таким образом позволить также добавленным РНКазам попасть внутрь, полного разрушения всех экзосомных РНК все равно не происходит. Так, например, RNY3, VTRNA1-1, C/D-box малые ядрышковые РНК, 5S рРНК, и U5 РНК были устойчивы к такой обработке. Авторы заключили, что эти РНК находятся в экзосомах в составе рибонуклеопротеиновых комплексов, защищающих их от РНКаз. В то же время остальные РНК скорее всего находятся внутри экзосом в свободном состоянии, и биологические причины этого пока остаются загадкой.
Длинные РНК в экзосомах — относительно короткие
Многие последовательности, полученные с помощью РНК-секвенирования, по-видимому, являются результатом присутствия ДНК-загрязнения препаратов экзосом. Использовав различные комбинации обработок растворителем, протеазами (чтобы разрушить белки) и нуклеазами (чтобы разрушить РНК или ДНК), авторы показали, что ДНК на самом деле может «прилипать» к поверхности экзосом снаружи. Является ли это биологически важным явлением или артефактом протокола получения экзосом — пока непонятно. Наличие ДНК-загрязнения может проявляться, например, в присутствии в результатах РНК-секвенирования интронных последовательностей из белок-кодирующих генов.
Обработка препарата экзосом ДНКазой позволила избавиться от ДНК-артефактов и убедиться в том, что некоторые транскрипты белок-кодирующих генов всё же действительно находятся в экзосомах. Обращает на себя внимание то, что большинство экзосомных мРНК короче 1500 нуклеотидов в длину, что неудивительно, если мы вспомним, что экзосомы — очень маленькие везикулы. Среди мРНК, наиболее часто встречались те, что кодируют рибосомные белки или другие белки, участвующие в трансляции. Эти мРНК содержат 5’-терминальные олигопиримидиновые последовательности (5′ terminal oligopyrimidine, 5′ TOP), которые позволяют координированно регулировать эти транскрипты на этапе их трансляции. Ученые полагают, что это — потенциальная связь между сообщениями в экзосомах и клеточным метаболизмом как выделяющих, так и принимающих экзосомы клеток.
Экзосомы образцовой чистоты
То, насколько мало мы знаем о внеклеточных везикулах, хорошо иллюстрирует факт: мы до сих пор не пришли к компромиссу по поводу оптимального способа их выделения и очистки. Все используемые на сегодняшний день методы имеют как ярко выраженные преимущества, так и существенные недостатки. Нахождение оптимального метода особенно важно, потому что внеклеточное пространство содержит огромное количество РНК, связанных с различными белками. Эти комплексы могут существенно загрязнять препараты внеклеточных везикул, и, как следствие, препараты их РНК.
К счастью, к этой проблеме ученые также подошли во всеоружии. Во-первых, они сконцентрировались на субпопуляции внеклеточных везикул — CD63+-экзосомах. Далее, они использовали тройную очистку экзосом — с помощью ультрацентрифугирования при ускорении в 100 000 g, градиента сахарозы и селекции с помощью антител (рис. 4). Центрифугирование с большим ускорением осаждает внеклеточные везикулы, отделяя их по массе от большинства белковых комплексов, загрязняющих препарат (см. рис. 1, A). Затем внеклеточные везикулы помещаются в 60-процентный раствор сахарозы и поверх него наносятся три слоя сахарозы меньших концентраций (40%, 20% и 0%). При центрифугировании за счет своей плотности (1,15–1,19 г/мл) экзосомы всплывают к границе слоев сахарозы с концентрациями 40% и 20%. На последнем этапе из препарата внеклеточных везикул с помощью антител к тетраспанину CD63 отлавливается субпопуляция экзосом, содержащая его в своих мембранах.
Рис. 4. Схема описанных в статье экспериментов по очистке препарата внеклеточных везикул. Среда клеток HEK293T, содержащая внеклеточные везикулы, была подвергнута нескольким раундам центрифугирования, после чего осадок был отделен от белковых загрязнений с помощью сахарозного градиента. Из полученного таким образом очищенного препарата внеклеточных везикул далее были очищены CD63+-экзосомы и их РНК для TGIRT-seq.
Такой тщательный подход позволяет утверждать, что представленный в обсуждаемой статье препарат экзосом, пожалуй, один из самых чистых из описанных в литературе на данный момент, а полученные авторами сведения о составе и механизме сортировки экзосомных РНК являются большим шагом навстречу лучшему пониманию функций экзосом и внеклеточных везикул вообще. Тем не менее мы не знаем, все ли экзосомы содержат тетраспанин CD63 и входит ли он в состав мембран микровезикул. Таким образом, вопрос о получении не загрязненного другими видами везикул препарата всех экзосом (а не их субпопуляции) остается открытым.
Как же все-таки РНК попадают в экзосомы? Как и во многих вопросах, касающихся экзосом (и внеклеточных везикул вообще), существует множество разрозненных исследований, пытающихся ответить на этот вопрос, используя примеры отдельных РНК. Однако до этого момента не было выведено никаких закономерностей. Авторы утверждают, что в случае с короткими РНК это происходит с помощью белка YBX1, который также присутствует в экзосомах, хотя механизм его работы пока не ясен. Так, тРНК, Y-РНК и Vault РНК накапливались в клетках, нокаутных по YBX1, не попадая в их экзосомы. Известно, что уровни экспрессии YBX1 повышены в опухолях. В это может быть сложно поверить, но мы знаем, что внеклеточные везикулы из опухолей могут превратить нормальную клетку в раковую. В таком случае, роль YBX1 в межклеточной коммуникации и регуляции опухолевого микроокружения может быть очень важной. При этом остается непонятным, как в экзосомы попадают мРНК, поскольку нокаут YBX1 никак не влияет на их присутствие в экзосомах.
Что мы имеем в итоге? Во внеклеточных везикулах РНК представлены короткими некодирующими РНК в полную длину. Большинство из них — тРНК, имеют отличительную модификацию в D-петле, которой нет у клеточных тРНК. Важно, что короткие РНК сортируются в экзосомы с помощью специального белка YBX1. Всё это свидетельствует в пользу гипотезы о том, что экзосомы (и, скорее всего, другие внеклеточные везикулы) — это не просто «мешки с клеточным мусором». Больше похоже на то, что это тщательно собранные посылки от одних клеток — другим. Тем не менее авторы не отвергают возможности, что YBX1 связывается именно с поврежденными, нефункциональными или просто находящимися в избытке короткими некодирующими РНК и направляет их в экзосомы, если они не связаны со своими обычными белковыми партнерами. РНК в экзосомах потом могут путешествовать к другим клеткам, дополняя или регулируя их метаболизм или же вызывая реакции клеточного иммунитета.
Если у вас имеется подробная инструкция по сборке, скажем, автомобиля, то вы, вполне вероятно, сможете разобраться в его устройстве. Но что делать, если у вас есть не инструкция целиком, а только случайные фрагменты ее страниц? Неожиданно для себя, большинство ученых, изучающих внеклеточные везикулы, оказались во второй ситуации. Всё из-за того, что, согласно ранее опубликованным экспериментальным данным, считалось, что генетический материал во внеклеточных везикулах (главным образом — короткие РНК) находится во фрагментированном состоянии. Теперь у нас есть не только подробная, цельная инструкция по сборке автомобиля, но и инструмент для тюнинга (YBX1-зависимый сортинг).
Источник: ЭЛЕМЕНТЫ БОЛЬШОЙ НАУКИ
