способен целенаправленно разрушать молекулы РНК — заставили работать в клетках человека. Ученые из Массачусетского технологического института показали, что при помощи CRISPR/Cas13 можно эффективно уничтожать мРНК выбранных генов, тем самым «выключая» их активность. Неактивную форму Cas13a, способную только связывать, но не расщеплять РНК, ученые приспособили для отслеживания локализации молекул РНК внутри клетки. Исследование опубликовано в Nature.
Комплекс белка Cas13 с РНК
Часто для оценки влияния конкретного белка на какой-то внутриклеточный процесс, исследователям требуется выключить ген, который его кодирует. Сделать это можно двумя способами — необратимо «сломать» ген, то есть внести в ДНК мутацию, которая нарушит его функцию, либо подавить его активность на уровне транскрипции, то есть синтеза матричной РНК.
В частности, изменить последовательность ДНК можно при помощи системы CRISPR/Cas9. Эта система состоит из белка Cas9, расщепляющего ДНК, и короткой направляющей РНК, которая «указывает» белку, где ему сделать разрез. В процессе залечивания клеткой разреза в ДНК, в последовательность гена вносится мутация.
Однако эффективность этого процесса не так высока, как хотелось бы, к тому же исследуемый ген может быть настолько важен для жизнедеятельности, что его необратимая поломка несовместима с жизнью. В таких случаях можно временно подавить транскрипцию гена при помощи РНК-интерференции. В основе этого процесса лежат маленькие молекулы РНК, комплементарные участку внутри матричной РНК (они называются малые интерферирующие РНК). Специальный белковый комплекс узнает матричную РНК, связанную с малой РНК, и расщепляет ее.
Эффективность подавления активности гена при помощи РНК-интерференции, как правило, меньше ста процентов, что позволяет работать даже с жизненно важными мишенями. Однако у этого способа есть и недостатки: во-первых, некоторые гены невозможно «заглушить» даже РНК-интерференцией, во-вторых, малые РНК не очень точно связываются со своей мишенью, что приводит к нецелевому уничтожению мРНК.
В прошлом году, было сообщено об открытии нового белка из семейства Cas, который способен направленно расщеплять одноцепочечную РНК, а не ДНК. Белок получил название С2с2, или Cas13a. В работе, опубликованной в журнале Science, исследователям удалось направленно уничтожить РНК бактериофага в клетках кишечной палочки, а также направить на деградацию мРНК флуоресцентного белка. Кроме того, новый белок был успешно использован для in vitro детекции нуклеиновых кислот в методе под названием SHERLOCK.
В новой работе ученые показали, что Cas13a из бактерии Leptotrichia wadei можно использовать и в клетках человека, а также в клетках растений (в клетках кишечной палочки тестировали белок из другого вида, Leptotrichia shahii), и что система CRISPR/Cas13 может эффективно заменить собой РНК-интерференцию.
Для начала авторы оптимизировали нуклеотидный состав гена Cas13 так, чтобы белок эффективно синтезировался в эукариотических клетках, и «пришили» к нему последовательность, обеспечивающую доставку в ядро. Эффективность расщепления РНК проверили на двух клеточных линиях человека и клетках риса. Эффективность выключения репортерного гена Gluc, кодирующего люциферазу, везде оказалась довольно высокой и составила около 75 процентов.
Сравнение эффективности и точности системы CRISPR/Cas13a и системы РНК-интерференции. График слева отражает количество нецелевых (off-target) мишеней для проб, используемых для РНК-интерференции (shRNA) и для CRISPR-выключения генов (LwaCas13a). График справа отражает эффективность выключения генов разными пробами.
После этого авторы проверили эффективность системы для подавления активности нескольких собственных генов человека на фибробластах и клетках меланомы. Для разных генов эффективность выключения составила в нескольких экспериментах от 30 до 85 процентов, что в среднем соответствовало эффективности контрольных проб для РНК-интерференции.
При помощи Cas13 авторам работы удалось существенно снизить количество транскриптов для генов, которые с использованием РНК-интерференции подавить не удавалось (MALAT1 и XIST). Важным преимуществом CRISPR/Cas13 перед интерференцией оказалась чувствительность связывания: по сравнению с малыми интерферирующими РНК, для которых было детектировано множество нецелевых мишеней, для Cas13 нецелевого связывания зарегистрировано вообще не было.
Введение мутаций в каталитический домен белка привело к тому, что Cas13a перестал разрезать РНК, и снижения количества транскриптов мишеней не происходило. Способность неактивного мутанта dCas13a специфически связывать молекулы РНК была использована в качестве метода для мониторинга матричных РНК в цитоплазме. Для этого белок dCas13a пришлось модифицировать таким образом, чтобы в отсутствие мишени он был сосредоточен в ядре и подавлял собственную транскрипцию. На примере мРНК гена актина (ACTB) авторы показали, что при помощи dCas13a можно детектировать накопление этих РНК в цитоплазме в составе стрессовых гранул — скоплений, которые образуются в неблагоприятных для клетки условиях. В присутствии направляющей РНК для гена актина dCas13a связывал мРНК этого гена и переходил в цитоплазму, а в присутствии контрольной РНК, которая его никуда не направляла, детектировался в ядре.
Модифицированный Cas13a может быть использован для мониторинга мРНК. Для того, чтобы локализовать несвязанный c мишенью белок в ядре, к нему пришили домен связывания с ДНК и репрессорный домен (с). В присутствии направляющей РНК для гена ACTB белок связывается с мРНК гена (d, f). На изображениях, полученных при помощи флуоресцентной микроскопии Cas13a, слитого с зеленым флуоресцентным белком, видно, что мРНК гена ACTB склонна накапливаться в цитоплазме в составе стресс-гранул. NT guide - контрольная направляющая РНК, не соответствующая никакому гену.
По мнению Константина Северинова, который поучаствовал в открытии нового белка, практическое применение в клетках нового Cas-белка с активностью РНКазы было вряд ли возможно. Однако его коллеги довольно быстро показали, что это не так. Станет ли Cas13 таким же популярным и незаменимым лабораторным инструментом, как РНК-интерференция и его «брат» белок Cas9, — время покажет.
Ранее ученым удалось заставить белок Cas9 связываться с РНК и расщеплять ее путем искусственной пришивки к нему РНКазы. При помощи варианта этого белка под названием RCas9, авторы смогли уничтожить скопления микросателлитной РНК в клетках, взятых у больных с миодистрофией.
Источник: N+1
