Известно, что белок AIRE участвует в развитии Т-лимфоцитов человека. В то же время есть данные о том, что мутации в этом белке связаны с бесплодием. Канадские ученые провели обширную работу по поиску белков, с которыми AIRE взаимодействует в эмбриональных клетках мыши, и обнаружили, что большинство из них участвует в формировании оси деления клеток. Это позволяет приблизиться к пониманию одной из причин бесплодия, а также разобраться, откуда взялась подобная многофункциональность белка AIRE.
Рис. 1. Белок AIRE в делящейся эмбриональной стволовой клетке мыши. ДНК окрашена голубым, клеточный скелет — зеленым, исследуемый белок AIRE — красным. Внизу справа — наложение двух меток. AIRE — известный регулятор иммунитета, однако недавнее исследование показало, что он активно участвует и в делении клеток зародыша. Длина масштабных отрезков 10 мкм.
Белок AIRE (autoimmune regulator) был впервые охарактеризован 20 лет назад. При его мутации развивается синдром MEDAC (MEDAC — акроним от Multiple Endocrine Deficiency, Autoimmune, Candidiasis, альтернативное название: аутоиммунный полиэндокринный синдром 1 типа, в ходе которого иммунитет атакует щитовидную железу и надпочечники, но могут также страдать печень, пищеварительный тракт, поджелудочная железа, половые и другие органы. Позже оказалось, что AIRE участвует в созревании Т-лимфоцитов, помогая клеткам тимуса «обучать» их игнорировать собственные антигены организма.
Общий принцип работы иммунной системы человека можно сформулировать так: сначала создать максимальное разнообразие, потом отобрать безопасные варианты. Поэтому в тимусе образуется популяция Т-лимфоцитов (или Т-клеток), каждая из которых несет уникальный рецептор и может распознать определенный антиген на поверхности клеток организма. Перед клетками тимуса стоит задача: избавиться от Т-лимфоцитов, которые узнают собственные белки организма. Этот процесс называется отрицательной селекцией (central tolerance), потому что выживают только те Т-лимфоциты, которые не узнают собственные антигены организма, остальные погибают в результате апоптоза. В итоге в живых остаются только Т-клетки, специфичные к чужеродным антигенам. И если они распознают какой-то из этих антигенов на клетке организма, это будет означать, что такая клетка либо заражена вирусом, либо трансформировалась в опухолевую, либо просто работает неправильно (например, синтезирует нетипичные для организма белки), и подлежит уничтожению.
Однако для эффективной селекции Т-клеток необходимо, чтобы они встретились со всеми возможными белками организма, в том числе и теми, которые в норме не должны бы появляться в клетках тимуса, но в большом количестве присутствуют в других органах. При этом ДНК, кодирующая ненужные тимусу белки, находится в нем в неактивном, свернутом состоянии, и информация с нее не считывается. И здесь приходит на помощь белок AIRE. Он связывается с гистонами — белками, на которые накручена нить ДНК, и привлекает туда другие ядерные белки, раскручивающие ее и запускающие считывание информации. При этом обычно AIRE действует на участки ДНК, называемые суперэнхансерами (super-enhancer), — они способны активировать считывание информации со множества генов сразу. Таким образом AIRE разворачивает недоступные области ДНК, и клетки тимуса получают возможность представить Т-клеткам большую часть антигенов организма. Несложно вообразить, что происходит при мутации по этому гену — Т-клетки, специфичные к собственным антигенам, не встречаются с ними, не подвергаются отбору и не погибают. Впоследствии, выйдя из тимуса в кровоток, они могут начать атаковать различные органы, нарушая их функции, — развивается аутоиммунное заболевание.
То есть главная задача AIRE — поддерживать в клетке тимуса экспрессию всех возможных генов. Если отвлечься от иммунной системы и посмотреть шире, окажется, что это ровно то самое, что необходимо клеткам зародыша на ранних стадиях развития. До определенного этапа из каждой эмбриональной клетки можно получить любую клетку взрослого организма, потому что она может синтезировать любые белки — это свойство называют плюрипотентностью. По мере развития зародыша клетки начинают специализироваться, и спектр их возможностей — потентность — снижается, равно как и уменьшается количество доступных для работы генов (в остальных областях ДНК скручивается и больше в жизни клетки не участвует). Получается, что AIRE теоретически мог бы поддерживать в клетках плюрипотентность. И действительно, оказалось, что он работает не только в тимусе, но и в эмбриональных стволовых клетках, выделенных из зародыша мыши на ранних (несколько дней) стадиях развития.
Помимо этого, AIRE обнаружили и в половых клетках. Так, в течение первого месяца после рождения у самцов млекопитающих предшественники сперматозоидов проходят суровый отбор на качество. Под действием AIRE они синтезируют разнообразные белки и, если какое-то количество белков содержит ошибки и сворачивается неправильно, то в клетках запускается механизм программируемой гибели. Всего отсеивается около 80% предшественников сперматозоидов. Если же подавить этот процесс, нормальный сперматогенез не происходит.
Но AIRE привлек внимание исследователей не только своей многозначностью в организме человека. Носители его мутации часто бесплодны, однако причина бесплодия остается невыявленной. Подозревают, что она не столько в атаке иммунной системы на половые органы, сколько в ошибках деления клеток зародыша. При неправильном расхождении хромосом на ранних стадиях развития возникает множество клеток с неравным количеством хромосом — анеуплоидных, что приводит к гибели эмбриона.
Авторы обсуждаемой статьи решили выяснить, как на самом деле работает AIRE в клетках эмбриона. Так как сам по себе этот белок не содержит участков, прочно связывающих ДНК, то логично предположить, что он привлекает другие белки, которые уже будут с ней взаимодействовать напрямую. Поэтому задачей в обсуждаемой статье стало выявление белков-партнеров, посредством которых AIRE осуществляет свои функции. Для этого они использовали метод BioID: в эмбриональных клетках экспрессировали гибридный белок, составленный из AIRE с «пришитой» к нему биотинлигазой. Последняя создает вокруг себя повышенную концентрацию биотина и навешивает его на все окружающие белки. Таким образом удается пометить все белки, которые оказываются в непосредственной близости к AIRE. Дальше их можно отобрать и определить.
Авторам статьи удалось выявить множество партнеров AIRE в клетке (рис. 2), но удивительным стал тот факт, что большинство из них относятся не к регуляции считывания информации (то есть транскрипции), а к обмену веществ и делению клетки (митозу). Ключевым событием митоза является формирование веретена деления: от двух полюсов деления отрастают микротрубочки, ловят хромосомы и выстраивают их по центру клетки, чтобы потом растащить поровну к полюсам. Оказалось, что многие белки-партнеры AIRE имеют отношение непосредственно к сборке микротрубочек и регуляции их перемещений.
Рис. 2. Распределение белков-партнеров AIRE по функциональным группам. Видно, что наибольшее их число принадлежит к группе «митоз» (Mitosis), то есть это белки, отвечающие за деление клетки.
Чтобы подтвердить этот факт, авторы отследили расположение AIRE в клетке по отношению к микротрубочкам, окрасив их антителами (рис. 3). Эксперимент с окрашиванием подтвердил, что AIRE связан с веретеном деления: он обнаружился как в зоне микротрубочек, так и на полюсах.
Рис. 3. Результаты окрашивания эмбриональной стволовой клетки мыши. Слева направо: ДНК (окрашено синим), микротрубочки (зеленые), полюса веретена деления (оранжевые), белок AIRE (красный). Правое фото — наложение всех меток. Длина масштабных отрезков 1 мкм.
В мутантных линиях клеток, лишенных экспрессии AIRE, деление было затруднено, а структура веретена деления нарушена — оно, как правило, имело больше полюсов, чем нужно (рис. 4).
Рис 4. Мутантные клетки, лишенные AIRE. Слева направо: полюса веретена деления (красные), микротрубочки (зеленые), ДНК (голубой). Правое фото — наложение всех меток. Длина масштабных отрезков 10 мкм.
Далее авторы задались целью выяснить, какой из доменов белка AIRE является критичным для его функционирования в клетке. Оказалось, что исчезновение домена, отвечающего за белок-белковые взаимодействия, оказывается фатальным: деление клеток нарушается, и веретено развивается неправильно. Это подтверждает высказанные ранее предположения о том, что основная функция AIRE — привлечение других белков. Интересно, что клетки, лишенные белка AIRE целиком, страдают меньше, чем клетки, содержащие мутантный AIRE (лишенный ключевого домена). Судя по всему, белковые комплексы как-то могут сформироваться в отсутствие AIRE, пусть и с меньшей эффективностью. А вот наличие дефектного белка просто не дает им образоваться. Эти же эффекты наблюдаются не только в культуре эмбриональных клеток, но и в живых клетках эмбрионов (рис. 5, 6).
Рис. 5. Здоровый (сверху) и лишенный функционального белка AIRE эмбрионы мыши. Белок AIRE окрашен зеленым, ДНК — голубым. Видно, что клеточная структура, характерная для нормального зародыша, в отсутствие AIRE не формируется. Длина масштабных отрезков 17 мкм.
Таким образом, авторы обсуждаемой статьи с разных сторон исследовали роль AIRE в клетках зародыша мыши на ранних стадиях развития. Исходя из полученных данных, они заключили, что AIRE участвует в сборке веретена деления, взаимодействуя как с ДНК, так и со множеством регуляторных белков, а также контролирует количество полюсов веретена. Однако эта его функция является ключевой только для эмбриональных клеток, поскольку в клетках взрослого организма деление регулируется без его участия, насколько известно на данный момент. Авторы статьи полагают, что это связано с повышенной частотой делений клеток зародыша по сравнению со взрослым организмом. Ускоренные деления приводят к тому, что клетка эмбриона не успевает запустить стандартные механизмы контроля клеточного цикла и проверить, что веретено собрано правильно. Это означает, что нужен какой-то дополнительный быстродействующий механизм, и его роль, видимо, выполняют AIRE и ассоциированные с ним белки.
Рис. 6. Деление клеток в здоровом (сверху) и лишенном функционального белка AIRE зародышах мыши. Окрашивание: красный — полюса веретена деления, зеленый — микротрубочки, голубой — ДНК, правые фото — наложение всех меток. Видно, что в отсутствие AIRE веретено формируется неправильно. Длина масштабных отрезков 2 мкм.
Обсуждаемое исследование проведено на клетках мыши, однако есть основания полагать, что клетки человека ведут себя сходным образом. Так, например, в экспериментах с мутантным белком AIRE, лишенным ключевого домена, была использована реальная мутация, обнаруженная у людей, страдающих аутоиммунной полиэндокринопатией. Эта мутация нарушила деление клеток у эмбриона мыши, что позволяет предположить, что с аналогичной проблемой сталкиваются и клетки зародышей человека. Однако не во всех экспериментах клетки, несущие мутантный AIRE, неизбежно погибали. Это означает, что не все мутации этого белка ведут к бесплодию, и хорошо согласуется с фактом, что не все люди, подверженные аутоиммунной полиэндокринопатии, бесплодны. А значит, вероятность развития бесплодия у человека как минимум зависит от конкретной мутации.
В то же время, авторы данного исследования поднимают еще один важный вопрос: как получилось, что один и тот же белок выполняет такие, казалось бы, несвязанные функции в организме? На самом деле, эти функции объединяет ключевое свойство AIRE — он способен связываться с нитью ДНК (как правило, неактивной, то есть скрученной) и привлекать к ней комплекс других белков. В делящейся клетке это будет комплекс, отвечающий за прикрепление к микротрубочкам, в покоящейся клетке это будут белки, запускающие раскручивание и транскрипцию. В зависимости от клеточного типа (эмбриональная клетка или клетка тимуса) и контекста одна и та же роль AIRE будет вызывать разный эффект.
Известны и другие белки, отличающиеся похожей многофункциональностью. Например, толл-подобные рецепторы позволяют клеткам иммунитета узнавать бактериальные и вирусные вещества и активируют иммунный ответ. При этом они же обнаружены на стволовых клетках, в которых регулируют выживание и деление. Эти эффекты связаны через общие пути передачи сигнала в клетке: при активации толл-подобных рецепторов запускается работа распространенного фактора транскрипции NF-kB, а уже его действие зависит от контекста. Иммунная клетка при активации будет, например, делиться и выделять провоспалительные белки, а стволовая — делиться и поддерживать плюрипотентное состояние.
Еще один похожий пример — белок AID (activation-induced cytidine deaminase). Сначала была открыта его функция в иммунной системе: он вызывает мутации генов иммуноглобулинов (то есть будущих антител), чтобы повысить их разнообразие. А потом его обнаружили в половых и эмбриональных клетках. Там он тоже вносит точечные мутации в ДНК, но в ее неактивных участках. В результате этого он привлекает белки системы репарации, которые эти мутации чинят, а заодно раскручивают ДНК. То есть это оказалось еще одним способом перевести ДНК в активное состояние.
На основании этих примеров авторы исследования выдвигают гипотезу, согласно которой функции подобных белков в зародышевом развитии первичны. А иммунная система, как более молодая (приобретенный иммунитет, для которого необходимы белки AIRE и AID, появляется только у позвоночных животных), воспользовалась уже имеющимися механизмами и адаптировала их под свои нужды. В связи с этим было бы интересно проследить за работой AIRE у других организмов и за эволюцией его функциональности.
Источник: ЭЛЕМЕНТЫ БОЛЬШОЙ НАУКИ
