Ученые из британского консорциума TRACERx отсеквенировали ДНК клеток рака легких из различных участков опухолей, удаленных хирургическим путем у ста пациентов. Им удалось проследить эволюцию генома каждой опухоли: были выявлены клональные мутации, с которых начиналось развитие рака, и субклональные, возникавшие позже. Набор мутаций у каждого пациента оказался индивидуальным. Зная, какие мутации искать, другая группа ученых из того же консорциума провела мониторинг ДНК, циркулирующей в плазме крови пациентов, после удаления опухолей. Это позволило выявить рецидивы и метастазы первичных опухолей задолго до того, как они становились видны на томограммах. Обсуждаемые работы представляются важным шагом на пути к внедрению в клиническую практику эффективных персонализированных методов диагностики и лечения.
Рис. 1. Мониторинг эволюции рака легких для раннего обнаружения рецидивов после удаления опухоли. В клинических исследованиях консорциума TRACERx для ста больных было проведено полное секвенирование кодирующих областей генома из различных участков (1–4) опухоли немелкоклеточного рака легких, удаленной хирургическим путем. Были идентифицированы мутации ДНК, присутствующие в опухоли (обозначены цветными крестиками). Среди них были выделены клональные мутации, присутствующие во всех клетках опухоли, и субклональные, возникшие позже и присутствующие лишь в некоторых участках. Для каждого пациента было построено филогенетическое дерево, показывающее эволюцию генома опухоли, накопление мутаций в процессе ее роста. На основании этих данных Эббош с соавторами разработали тест, в котором анализировалась циркулирующая в плазме крови опухолевая ДНК (ctDNA). Этот тест обнаруживал рецидивы рака (в данном случае метастаз, локализованный в другом легком) задолго до того, как их удавалось найти с помощью компьютерной томографии.
По данным Всемирной организации здравоохранения, рак легких — самая частая причина смерти от онкологических заболеваний. Наиболее значимым провоцирующим его фактором считается курение, однако могут заболеть и люди, которые никогда не курили и не имели очевидных контактов с другими известными факторами риска (асбест, радон и др.). Ежегодно в мире регистрируется порядка 1,8 млн новых случаев рака легких и порядка 1,6 млн пациентов от него погибают.
По гистологической картине клеток опухоли рак легких разделяют на несколько типов. Самый частый из них (примерно 80% случаев) — плохо поддающийся лечению немелкоклеточный рак легких, НМРЛ (Non-small-cell lung carcinoma, NSCLC). Среди НМРЛ по гистологии выделяют плоскоклеточный и крупноклеточный рак, аденокарциному и некоторые другие, редко встречающиеся подтипы. НМРЛ очень часто дает метастазы в различные органы, и каждый год более миллиона пациентов погибают от метастазов, а не от первичной опухоли. Превентивная послеоперационная химиотерапия повышает выживаемость пациентов всего на 5%. Это может быть связано с высокой генетической гетерогенностью (см. Genetic heterogeneity) клеток опухолей: по-разному мутировавшие раковые клетки могут быть чувствительны или, наоборот, устойчивы к совершенно разным лекарствам.
Британский консорциум TRACERx (TRAcking non-small cell lung Cancer Evolution through therapy [Rx]) проводит широкомасштабное исследование на опухолях НМРЛ, в котором участвуют несколько клиник и несколько сот пациентов. Его результаты для ста пациентов опубликованы в работе в The New England Journal of Medicine. Полное секвенирование кодирующих последовательностей ДНК из различных участков удаленных опухолей позволило выявить мутации, присутствующие в опухоли каждого больного. Некоторые из них обнаруживались практически во всех участках (клональные мутации) — очевидно, потому, что возникли на ранних стадиях развития опухоли. Другие мутации, наряду с клональными, обнаруживались лишь в некоторых участках и, следовательно, возникли позже (субклональные мутации). Наборы мутаций у различных пациентов были индивидуальными.
В качестве клональных ожидаемо часто обнаруживались мутации генов EGFR, MET, BRAF и TP53, которые известны как драйверы онкогенеза (то есть связаны с инициацией и развитием раковых опухолей). Среди субклональных могли быть как мутации, усугубляющие злокачественность клеток (то есть их способность к неконтролируемому росту), так и не имеющие прямого отношения к раку, а возникшие вследствие общего нарушения процессов репарации поврежденной ДНК. На основании распределения мутаций были построены филогенетические деревья, показывающие историю роста и прогрессии опухоли на молекулярном уровне (рис. 1, 2).
Рис. 2. Филогенетическое дерево, показывающее эволюционные взаимоотношения различных участков опухоли и метастаза по мутациям, найденным в первичной опухоли и метастазе одного из пациентов. Цветные кружки — клоны мутаций, обнаруженные в опухолевой ДНК, циркулирующей в кровотоке (ctDNA); серые кружки — не обнаруженные; крупный кружок — клональные мутации. Числа 135, 167 — количество мутаций; длина неперечеркнутых ветвей дерева пропорциональна количеству мутаций. Красный пунктир — ответвление к рецидиву (метастазу). Цветные или белые участки в прямоугольниках обозначают пары праймеров, с помощью которых удалось обнаружить соответственно окрашенные мутации. amp — амплификация, del — делеция, P1 — первичная опухоль, R1–R5 — участки первичной опухоли, М1 — метастаз.
Логичное продолжение и развитие этих исследований — работа, также выполненная в рамках проекта TRACERx и опубликованная в журнале Nature. Проследить эволюцию опухолей НМРЛ в организме пациента в процессе клинических наблюдений и лечения позволил уже применявшийся ранее, но сравнительно новый подход — жидкостная биопсия. При обычной биопсии врач берет для исследования фрагмент раковой опухоли, но при этом можно получить информацию лишь об ограниченном участке опухоли, а главное, опухоль нужно сначала детектировать (например, при помощи компьютерной или магнитно-резонансной томографии). Принцип жидкостной биопсии основан на анализе циркулирующей в плазме крови ДНК, цДНК (Circulating tumor DNA, ctDNA). Она появляется в результате постоянно происходящего в организме распада и обновления тканей. При раке в крови можно найти не только фрагменты ДНК нормальных клеток, но и ДНК отмирающих клеток из различных участков опухоли. цДНК теоретически можно секвенировать (определить нуклеотидную последовательность) и получить таким образом комплексную информацию о новообразованиях, которые развиваются в организме, — в том числе и тех, которые пока не видны на томограммах.
Трудность состояла в том, что цДНК может составлять лишь менее 1% ДНК, обнаруживаемой в плазме крови. Чтобы найти эту «иголку в стоге сена», английские ученые целенаправленно искали те мутации, которые были обнаружены в результате секвенирования ДНК из различных участков ранее удаленной опухоли того же пациента. Авторы работы существенно усовершенствовали процедуру обнаружения мутаций. Они применили так называемую мультиплексную полимеразную цепную реакцию для амплификации (увеличения количества, накопления) целевых фрагментов ДНК с последующим секвенированием. При этом в одной реакционной смеси авторы амплифицировали и затем секвенировали не один, как обычно, а сразу несколько фрагментов ДНК. Это значительно ускоряло работу. В рассматриваемом исследовании одновременно анализировали до 28 различных фрагментов. А методы высокоэффективного секвенирования (секвенирования нового поколения) позволили уловить и определить нуклеотидную последовательность мутантного фрагмента ДНК на фоне тысяч нормальных фрагментов.
Для каждого из 96 пациентов, участвующих в исследовании, выбрали от 10 до 22 аномалий (точечных мутаций, делеций, амплификаций генов, перестроек хромосом) из числа обнаруженных в ДНК удаленной опухоли. Для начала ученые попытались обнаружить эти аномалии в сохраненной плазме крови, взятой у пациентов перед удалением опухоли. Это отчасти удалось сделать: по крайней мере две аномалии обнаруживались в 48% случаев (46 из 96) и одна аномалия — еще в 12 случаях. Успешность обнаружения была разной для разных подтипов НМРЛ: при плоскоклеточном раке, при котором опухоль быстро обновляется и образуются ее обширные некрозы, мутации обнаруживались в 97% случаев (30 из 31), а при аденокарциномах, в которых некрозы не так обширны, лишь в 19% (11 из 58).Эти аномалии можно было потом детектировать при последующих жидкостных биопсиях.
Для 24 пациентов (из тех, у кого в крови, взятой до операции, детектировалась цДНК) после операции был проведен мониторинг рецидивов и метастазов путем регулярного тестирования ДНК из плазмы крови. Результат получился весьма впечатляющим. Вскоре после операции цДНК практически полностью исчезала. А рецидивы или метастазы можно было обнаружить по достоверному количеству вновь появляющейся цДНК в среднем за 70 дней, а в приведенном на рис. 3 случае даже за 347 дней до того, как их выявляла компьютерная томография. Таким образом, жидкостная биопсия оказывается намного более чувствительной, чем компьютерная томография. Это важно по крайней мере с двух точек зрения. Во-первых, лечение рецидивов нужно начинать как можно раньше. Во-вторых, результаты могут позволить определить, какую именно терапию следует применить. Так, для одного из пациентов было показано, что рецидивируют клетки, несущие клональную онкогенную амплификацию гена ERRB2. В этом случае целесообразно применить химиотерапевтические средства, эффективно подавляющие продукт этого гена.
Рис. 3. Обнаружение мутантной цДНК позволяет рано распознать рецидив рака после операции. Определялись две мутации — клональная (голубые кружки) и субклональная (красные треугольники); VAF — variant allele frequency. После достоверного обнаружения рецидива по клональной мутации (мутантная цДНК составляла 0,1% от общей ДНК плазмы) была сделана компьютерная томография (CT — computed tomography), которая сначала дала отрицательный результат (Normal CT) и лишь через 347 дней положительный (R — relapse, «рецидив»).
Еще одной важной находкой авторов оказалась возможность с помощью жидкостной биопсии оценить размер опухоли по частоте встречаемости мутантного варианта относительно общего объема ДНК плазмы крови. По сделанным оценкам, доля мутантной ДНК 0,1% соответствует примерно 300 млн клеток опухоли (рис. 4). Таким образом, жидкостная биопсия может позволить оценивать эффективность терапии: если размер опухоли уменьшится, это отразится на количестве цДНК.
Рис. 4. Частота встречаемости мутантной цДНК по отношению к суммарной ДНК в плазме крови коррелирует с величиной опухоли. a. Величина опухолей, определенная с помощью компьютерной томографии, коррелирует с частотой встречаемости клональных мутаций в ДНК плазмы крови (VAF). LUCD — плоскоклеточный рак легких, LUAD — аденокарцинома легких, Other — другие типы рака. Красно-коричневая область показывает 95-процентные интервалы достоверности. b. Предсказываемая частота встречаемости клональных мутаций в ДНК плазмы крови при гипотетических размерах опухолей.
Несмотря на то что жидкостная биопсия с анализом цДНК показала высокую эффективность для мониторинга рецидивов рака, она пока остается технически довольно сложной (требуется амплификация ДНК, ее секвенирование), трудоемкой и просто дорогой. Поэтому говорить о ее внедрении в широкую медицинскую практику еще рано. Но стоимость биотехнологий, особенно секвенирования, постоянно снижается, и применение этого прецизионного индивидуального подхода в клинической практике может стать реальным уже в ближайшем будущем.
Источник: ЭЛЕМЕНТЫ БОЛЬШОЙ НАУКИ
