Ученые из Калифорнийского университета в Беркли выяснили, каким образом в бактериальные CRISPR-системы, необходимые для защиты от инфекций и широко используемые в методах современной генной инженерии, встраиваются новые участки ДНК. Выяснилось, что для правильного и точного встраивания необходима кооперация интегразной системы Cas1-Cas2 и фактора IHF, причем ДНК при этом изгибается, подобно подкове, и ключевым фактором здесь является правильная геометрия механизма, а не точные нуклеотидные последовательности внутри кассеты CRISPR. Исследование опубликовано в Science.
Первичные этапы взаимодействия интегразного комплекса, принесшего "чужую" ДНК, и CRISPR-кассеты
CRISPR-кассета устроена следующим образом: это участок генома, содержащий серию повторов длинной 20-50 нуклеотидов, разделенных «спейсерами» — участками ДНК, например, вирусными, которые система использует как своего рода справочник при борьбе с инфекциями. Если попавшая в клетку ДНК похожа на то, что лежит в справочнике, специальные белки ее узнают и разрезают — это называют иммунным ответом бактериальной клетки.
Новые спейсеры вставляются в CRISPR с помощью интегразного комплекса, состоящего из 4 белков Cas1 и двух белков Cas2. Комплекс вставляет новый спейсер в начало кассеты, перед первым ее повтором, который следует за АТ-богатой лидерной последовательностью. Место, куда вставляется новый спейсер, должно выбрано правильно, потому что при встраивании ДНК в произвольный участок генома, кроме всего прочего, может произойти нарушение работы бактериальных генов.
Известно, что в CRISPR системах в процесса интеграции спейсеров участвуют лидерная последовательность, первый повтор и, в частности, инвертированный повторный GC-богатый участок внутри него. Фактор связывания IHF (Integration Host Factor), похожий на эукариотические гистоны, связывается с лидерной последовательностью и подключает к процессу Cas1-Cas2 комплекс. Ученые решили исследовать этот механизм, детали которого до сих пор были не ясны.
С помощью методов электронной микроскопии и рентгеноструктурной кристаллографии им удалось получить структуры комплексов интегразы и субстратной (инфекционной) и геномной ДНК на промежуточной и финальной стадиях процесса интеграции.
Выяснилось, что благодаря структуре кассеты (в частности, наличию в ней повторов), IHF может согнуть ее, подобно подкове, открывая при этом доступ интегразе к необходимым ей участкам. IHF связывается для этого с двумя сайтами. При этом непосредственного химического контакта (образования водородных связей) между интегразой и геномной ДНК почти не происходит, исключение составляют только несколько водородных связей в месте, где седьмая α-спираль Cas1 входит в малую бороздку спирали ДНК около лидерной последовательности. Основным фактором процесса интеграции являются, однако, не водородные связи, а именно правильная его геометрия, которая достигается за счет определенного расположения сайтов связывания белков и структуры ДНК самой кассеты. GC-богатый инвертированный повторный участок позволяет изогнуть ДНК, участок в середине первого повтора действует как дверная петля, а IHF держит всю эту конструкцию. Точного распознавания сайтов по нуклеотидам сам интегразный комплекс не осуществляет, что лишний раз подчеркивает неселективную природу траспозазы Cas1, описанную во многих исследованиях.
IHF загибает ДНК в подковообразную структуру, после чего происходит взаимодействие Cas1 со своими сайтами
Оказалось также, что при отсутствии IHF гораздо чаще происходит встраивание субстратной ДНК в произвольные участки бактериального генома. При перенесении участка его связывания на пять нуклеотидов в сторону такого не происходит, но снижается эффективность интеграции. Таким образом, правильное взаимодействие IHF и интегразного комплекса Cas1-Cas2 оказывается ключевым для точного и эффективного встраивания новых спейсеров в кассету CRISPR.
При этом, как уже говорилось выше, интегразному комплексу важна структура объекта, куда он будет встраивать новые последовательности, но не конкретные нуклеотидные последовательности внутри него. Возможно, именно с этой особенностью связано огромное разнообразие CRISPR-кассет в бактериях. Ученые считают, что подобный уникальный механизм интегразного комплекса Cas1-Cas2 можно использовать в качестве "молекулярного записывающего устройства" для баркодирования геномов или для нестандартных локус-специфичных встроек.
Источник: N+1
