Ключевую роль в эмбриональном развитии животных играют градиенты концентрации сигнальных веществ — морфогенов, распространяющихся в межклеточном пространстве. Градиенты морфогенов несут позиционную информацию, благодаря которой каждая клетка может «понять», в какой части эмбриона она находится, и в соответствии с этим решить, как ей дальше развиваться. Однако концентрацию морфогена невозможно отрегулировать с абсолютной точностью. Остается неясным, как клеткам удается принимать четкие и правильные решения на основе расплывчатых входных данных. Международный коллектив эмбриологов сумел разобраться в том, как справляются с этой проблемой клетки нервной трубки эмбрионов позвоночных. Оказалось, что клетки извлекают точную информацию о своей позиции из двух неточных градиентов, направленных в противоположные стороны. Принцип декодирования, который они при этом используют, соответствует математически оптимальному для решения данной задачи методу «максимального правдоподобия».
Рис. 1. Нервная трубка мышиного эмбриона в поперечном разрезе (на уровне зачатков передних лапок). Вверху — спинная, или дорзальная, сторона (D), где производится морфоген BMP, внизу — брюшная, или вентральная, сторона (V), где производится морфоген Shh. На фотографии слева красный цвет отражает концентрацию BMP, зеленый — Shh. Справа — схема разметки нервной трубки, отражающая ее итоговое разделение на отделы с разными типами нейронов. Pax7, Olig2, Nkx2.2 — транскрипционные факторы, которые включаются в клетках в зависимости от концентрации морфогенов. Pax7 маркирует дорзальные отделы будущего спинного мозга, Nkx2.2 — вентральный отдел. NC (notochord) — хорда, FP (floorplate) — донная пластинка (здесь вырабатывается Shh), RP (roofplate) — потолочная пластинка, где вырабатывается BMP.
Одна из главных «подсказок», используемых эмбриональными клетками при выборе своей судьбы, — это пространственная разметка эмбриона (или отдельных его частей), осуществляемая при помощи градиентов концентраций сигнальных белков — морфогенов, таких как Wnt (Сигнальный путь Wnt), Shh (sonic hedgehog) или BMP (Костный морфогенетический белок). Морфоген обычно производится какой-либо локальной группой клеток и распространяется путем диффузии, причем концентрация морфогена падает по мере удаления от места его производства.
От концентрации морфогенов в межклеточном пространстве зависит, какие наборы регуляторов следующего уровня — транскрипционных факторов (ТФ) — активируются внутри клеток. ТФ в свою очередь регулируют экспрессию множества генов, работа которых и определяет судьбу клетки.
Градиенты морфогенов несут «позиционную информацию». Теоретически, зная концентрацию одного или нескольких морфогенов в окружающем межклеточном пространстве, каждая клетка может определить, где она находится, и в зависимости от этого включить тот или иной набор ТФ, что и будет соответствовать выбору клеткой своей судьбы (см. Cell fate determination).
В развитии нервной трубки позвоночных ключевую роль играют морфогены BMP и Shh, которые формируют антипараллельные (направленные в противоположные стороны) градиенты. На дорзальной (спинной) стороне нервной трубки производится BMP, а на вентральной (брюшной) — Shh. Соответственно, в нервной трубке снизу вверх постепенно растет концентрация BMP и падает концентрация Shh. Эти градиенты сообщают клеткам позиционную информацию, которая используется для аккуратного разделения нервной трубки в дорзо-вентральном направлении на несколько отделов. Клетки каждого отдела в дальнейшем дают начало нейронам определенного типа.
Кодирование позиционной информации при помощи концентрации морфогена — это пример аналогового кодирования, которое чревато ошибками, поскольку концентрацию нельзя отрегулировать с абсолютной точностью. По идее, ошибка должна нарастать по мере удаления от центра производства морфогена. Группа эмбриологов из Австрии, Швейцарии и Великобритании попыталась разобраться в том, как клетки нервной трубки справляются с этой проблемой.
Сначала исследователи оценили концентрации морфогенов BMP и Shh на разных расстояниях от верхнего и нижнего краев нервной трубки на разных стадиях развития. Для этого используются хитроумные окольные методы, связанные с окрашиванием белков, появление которых в клетке является непосредственным ответом на связывание морфогенов с рецепторами, сидящими на клеточной мембране. Как и ожидалось, сила сигнала BMP оказалась максимальной на спинной стороне нервной трубки, Shh — на брюшной. По мере удаления от спинного края концентрация BMP экспоненциально снижается, и точно так же ведет себя концентрация Shh по мере удаления от брюшного края (рис. 2, левый график).
Рис. 2. Слева: интенсивность сигналов, получаемых клетками нервной трубки от морфогенов BMP (красные линии) и Shh (синие линии) на разных расстояниях от спинного и брюшного краев и на разных стадиях развития. По горизонтальной оси — расстояние от спинного края в долях от дорзо-вентрального диаметра нервной трубки (0 — спинной край, 1 — брюшной край, x — абсолютное расстояние от спинного края, L — дорзо-вентральный диаметр нервной трубки). Разные оттенки красного и синего отражают разные стадии развития (см. шкалу справа; время отсчитывается, говоря предельно упрощенно, в часах от момента формирования нервной трубки). Справа приведен аналогичный график, показывающий уровни экспрессии «спинного» транскрипционного фактора Pax3 и «брюшного» ТФ Nkx6.1. Смысл этого графика в том, что на ранних стадиях экспрессия ТФ контролируется морфогенами, но потом переходит на самоуправление (см. пояснения в тексте).
Следующей задачей была оценка точности позиционной информации, заключенной в градиентах концентрации морфогенов. Разумеется, эти градиенты не могут быть (и не являются) абсолютно одинаковыми у всех эмбрионов. Существует некая неустранимая вариабельность, а значит, определить свою позицию по концентрации морфогена клетка может лишь приблизительно.
Авторы рассчитали, с какой точностью можно в принципе определить положение точки (или клетки) в нервной трубке, зная концентрацию одного из морфогенов (или обоих сразу) в этой точке. Результаты расчетов отражены на рис. 3.
Рис. 3. Величина ошибки, с которой можно определить положение точки относительно спинного и брюшного краев нервной трубки (Positional error), зная концентрацию BMP (левый график), Shh (средний график) и обоих морфогенов сразу (правый график). По горизонтальной оси — расстояние от спинного края (как на рис. 2). Разные оттенки серого соответствуют разным стадиям развития (см. шкалу справа). Горизонтальная пунктирная линия показывает уровень точности в три клеточных диаметра. Примерно с такой точностью нервная трубка подразделяется на отделы в реальности.
Оказалось, что вблизи спинного края, где концентрация BMP высока, можно уверенно сориентироваться, зная только эту концентрацию. Вблизи брюшного края столь же надежную позиционную информацию дает концентрация Shh. Но вот в центральной части, где концентрации обоих морфогенов низкие, ни та, ни другая концентрация по отдельности не может служить надежным ориентиром. Это видно по тому, как убегают вверх кривые на левом и среднем графиках на рис. 3. Особенно быстро с удалением от краев теряется точность позиционной информации на поздних стадиях развития нервной трубки (поздним стадиям соответствуют темные кривые).
Но все-таки клетка, находящаяся в средних секторах нервной трубки, может правильно «вычислить» свою позицию, по крайней мере на ранних стадиях (в первые 30 часов). Для этого она должна учесть концентрации обоих морфогенов одновременно. Это видно на правом графике на рис. 3, где три самые светлые кривые на всем своем протяжении располагаются довольно низко и почти не выходят за горизонтальную пунктирную линию. Эта линия соответствует позиционной ошибке в плюс-минус три клеточных диаметра: именно с такой точностью нервная трубка подразделяется на отделы в ходе развития мышиного эмбриона.
С математической точки зрения, оптимальным способом извлечения точной позиционной информации из двух неточных градиентов является метод максимального правдоподбия. Зная среднее значение и разброс (дисперсию) концентраций обоих морфогенов в каждой позиции (от спинного края до брюшного), можно для каждого сочетания двух концентраций вычислить распределение вероятностей того, что такое сочетание будет наблюдаться в той или иной позиции. Затем для каждого сочетания можно будет выбрать наиболее вероятную позицию. Совокупность таких наиболее вероятных позиций для каждого сочетания концентраций Shh и BMP формирует «карту декодирования» (decoding map) (рис. 4, левая диаграмма).
Рис. 4. Примеры «карт декодирования», которые можно использовать для извлечения позиционной информации из антипараллельных градиентов Shh и BMP. Разными цветами показаны разные позиции вдоль дорзо-вентральной оси (DV). На каждой карте по горизонтали откладывается концентрация BMP, по вертикали — Shh. Левая карта построена при помощи метода максимального правдоподобия. Серым цветом показана область, где распределение вероятностей получается двугорбым: в этой области метод максимального правдоподобия подсказывает, что клетка находится либо у вентрального, либо у дозрального края (но точно не в середине), и не позволяет сделать однозначного выбора. Средняя карта извлекает позиционную информацию из соотношения двух сигналов ([Shh]/[BMP]), правая — из их разности ([Shh]−[BMP]). Наклонная черная линия с точками отражает усредненную ситуацию в нервной трубке нормального мышиного эмбриона (WT); точки соответствуют позициям, удаленным друг от друга на одинаковые расстояния. Наклонная зеленая линия соответствует мышам-мутантам с ослабленной активностью Shh (Shh Hypo). У таких мышей вентральные отделы нервной трубки оказываются сильно сжатыми в дорзо-вентральном направлении, а центральные и дорзальные, наоборот, растягиваются.
Извлекать позиционную информацию из градиентов двух морфогенов в принципе можно и другими способами. Например, можно ориентироваться на соотношение двух концентраций (тогда получится карта декодирования, показанная на средней диаграмме на рис. 4) или на их разность (правая диаграмма на рис. 4). Правда, эти методы декодирования не дают требуемой точности при интерпретации неточных градиентов. В этом случае точность разметки нервной трубки была бы ниже наблюдаемой, и положение границ средних отделов нервной трубки сильнее варьировало бы от эмбриона к эмбриону.
Различия между методами декодирования нагляднее всего проявляются в области высоких и при этом одинаковых концентраций обоих морфогенов. С таким сочетанием концентраций BMP и Shh клетки в реальности не сталкиваются: в нервной трубке нет таких позиций, где сигналы Shh и BMP были бы одинаковыми и при этом сильными. Но такую ситуацию можно создать искусственно. Как поведут себя клетки нервной трубки в этом случае? Если они ориентируются на соотношение или на разность сигналов, то им неважно, что оба сигнала — сильные, а важно лишь то, что они одинаковые. Следовательно, клетки выберут «среднюю» судьбу (начнут производить ТФ, характерные для средних отделов нервной трубки).
Метод максимального правдоподобия в этой ситуации дает характерный сбой. Распределение вероятностей получается двугорбым. Иными словами, клетка будет «думать», что она находится то ли очень близко к брюшному краю (потому что высока концентрация Shh), то ли к спинному (потому что высока концентрация BMP). Но предположение о том, что она находится посередине, будет решительно отвергнуто, ведь ему противоречат сразу обе концентрации.
Чтобы выяснить, какой из возможных «карт декодирования» пользуются клетки нервной трубки, авторы провели серию экспериментов с культурами клеток нервной пластинки куриного эмбриона. Ранние стадии развития центральной нервной системы у мыши и курицы заведомо основаны на одних и тех же принципах и сигнальных веществах, поэтому выбор объекта здесь диктуется только соображениями удобства.
Клетки подвергали действию Shh и BMP в разных концентрациях и следили за тем, какие ТФ (спинные, средние или брюшные) включатся в клетках при данном сочетании концентраций. Эксперименты подтвердили, что при сильном сигнале Shh и слабом BMP включаются брюшные ТФ, при обратной ситуации (когда много BMP и мало Shh) — спинные. Если же оба сигнала слабы, включаются средние ТФ. Все это полностью соответствует тому, что наблюдается в развитии реальных эмбрионов, и согласуется с любым из трех вариантов декодирования, показанных на рис. 4.
Самые показательные результаты получились, когда клетки поместили в среду с одинаково высокими концентрациями обоих морфогенов. Оказалось, что в этой ситуации клетки не выбирают себе «средние» судьбы, как они бы обязательно поступили, если бы ориентировались на соотношение концентраций или их разность. Вместо этого клетки выбирают наугад либо дорзальную, либо вентральную судьбу. В клеточной культуре образуется беспорядочная смесь клеток, одни из которых производят спинные ТФ, другие — брюшные, но практически никто не производит средние. Именно так повел бы себя всякий, кто решил использовать для декодирования позиционной информации метод максимального правдоподобия. Напомним, что этот метод является оптимальным с точки зрения точности позиционной информации, извлекаемой из двух расплывчатых и вариабельных градиентов.
Таким образом, исследование приблизило нас к пониманию общих принципов расшифровки клетками эмбриона позиционной информации, закодированной в градиентах морфогенов.
Разобраться в том, как устроен механизм декодирования на молекулярном уровне (то есть на уровне регуляторных генных сетей; см.: М. Никитин. Генные сети, управляющие строением тела животных) — задача на будущее. Впрочем, кое-что можно сказать уже сейчас. Например, очевидно (и авторы подтвердили это при помощи моделирования), что для того, чтобы плавные градиенты морфогенов превратились в четкую пространственную разметку, разные группы ТФ (спинные, средние, брюшные) обязательно должны находиться друг с другом в антагонистическом взаимодействии. Например, включение средних ТФ должно подавлять экспрессию спинных и брюшных ТФ, чтобы они не вздумали включиться в той же клетке. Только так можно обеспечить определенность отделов нервной трубки и четкость границ между ними.
Из этого следует, что начало устойчивой экспрессии определенного набора ТФ (например, брюшных) соответствует принятию клеткой окончательного и бесповоротного решения. Это и называют «выбором клеткой своей судьбы» (cell fate decision).
Исходя из сказанного, логично предположить, что концентрации морфогенов должны оказывать на клетку заметное влияние только на ранних этапах развития — до того момента, когда в клетке установится стабильный уровень экспрессии определенного набора ТФ. После этого отделы нервной трубки должны выходить из-под контроля морфогенов, переходя на самоуправление.
В обсуждаемой статье авторы осветили данное явление еще с одной стороны: они показали, что на ранних этапах (в первые 30 часов развития нервной трубки) уровни экспрессии дорзальных и вентральных ТФ меняются вдоль дорзо-вентральной оси плавно, строго следуя за концентрациями Shh и BMP. На этом раннем этапе график уровня экспрессии дорзальных ТФ выглядит так же, как график концентрации BMP, а вентральных — как Shh (светлые кривые на левом и правом графиках на рис. 2 похожи друг на друга). Но затем ситуация меняется: графики экспрессии ТФ становятся ступенчатыми (то есть у областей, где экспрессируются эти ТФ, появляются четкие границы), а корреляция с Shh и BMP исчезает (темные кривые на правом графике на рис. 2 не похожи на соответствующие кривые на левом графике). Это и значит, что клетки, уже определившиеся с тем, какой набор ТФ они будут экспрессировать, выходят из-под контроля морфогенов и переходят на саморегуляцию.
Источник: ЭЛЕМЕНТЫ БОЛЬШОЙ НАУКИ
