Фактор с уникальным многообразием функций: способствует экспрессии генов, участвует в клеточном делении, помогает «чинить» геном и, главное, правильно упаковывает ДНК. Да-да, в этом самая суть. FACT одинаково хорош и для дрожжей, и для человека — это шаперон гистонов, который почти не изменился в ходе эволюции. И вот такой многофункциональный и консервативный, на стыке двадцатого и двадцать первого века он заставил ученых предположить существование особого процесса в молекулярной биологии — изменения структуры хроматина без затрат энергии.
Как известно, все клетки многоклеточного организма содержат одну и ту же ДНК (геном), однако обладают разными свойствами: в организме человека, например, насчитывается несколько сотен специализированных типов клеток. В разных клетках работают (экспрессируются) разные наборы генов, за счет этого и достигается такое разнообразие тканей организма. И хотя ученые давно расшифровали генетический код, мы до сих пор плохо понимаем, как именно гены включаются и выключаются.
Известно, что важную роль в этом играют транскрипционные факторы — белки, которые садятся на ДНК в особых точках (сайтах связывания) и привлекают туда РНК-полимеразу, считывающую с гена мРНК, необходимую для синтеза определенного белка.
Другим, более общим, механизмом, регулирующим активность генов в клетке, является упаковка хроматина (комплекса ДНК и основных упаковочных белков-гистонов). Считается, что гены в плотно упакованной фракции хроматина выключены и недоступны действию факторов транскрипции, а в «открытом» хроматине — наоборот.
Катушки для генома
Наследственная информация эукариот закодирована в молекуле ДНК, которая плотно упакована в ядре клетки. Упаковка эта заключается в том, что ДНК связана с белками-гистонами, которые обеспечивают правильную укладку генома и играют ключевую роль в регуляции его экспрессии. Такой ДНК-белковый комплекс называется хроматином. Повторяющейся единицей хроматина является нуклеосома — «катушка ниток», в которой ДНК-«нитка» совершает примерно два витка вокруг основания из гистонов — «катушки». Структура нуклеосомы была расшифрована Каролин Люгер (рис. 1) с коллегами в 1997 году.
Рисунок 1. Каролин Люгер и расшифрованная ею в 1997 году структура нуклеосомы.
Оказалось, что нуклеосома представляет собой довольно плотный комплекс (рис. 1), практически не изменившийся в ходе эволюции, что лишь подчеркивает его значимость для всего живого.
Чем же нуклеосомы заслужили нашу любовь? Ну, они позволяют, во-первых, упаковать огромный геном эукариот в микроскопическое ядро (видео 1), а, во-вторых, управлять им. Белки-гистоны не просто выполняют механическую функцию катушки. Именно они сигнализируют молекулярным машинам клетки, что вот тут, именно в этом месте, находится активный ген. Или, наоборот, неактивный. Или что в данной точке ДНК повреждена, и надо как-то спасать ситуацию. Ну и так далее. Короче говоря, если бы не нуклеосомы, то с геномом была бы полная путаница. И в прямом и в переносном смысле.
Важная роль в образовании правильной структуры хроматина принадлежит шаперонам гистонов. Белки-шапероны укладывают биологические молекулы так, чтобы они могли выполнять свои функции. Шапероны гистонов, в свою очередь, строят нуклеосомы.
Видео ссылка 1. Сворачивание ДНК в хромосому
Немного истории
Термин «молекулярный шаперон» впервые использовал в 1978 году Рон Ласкей (рис. 2), профессор эмбриологии из Кембриджского университета, в работе по описанию ядерного белка нуклеоплазмина, предотвращающего агрегацию белков-гистонов с ДНК при образовании нуклеосом. Гистоны содержат множество положительно заряженных аминокислот, которые обладают большим сродством к отрицательно заряженным фосфатным группам в ДНК (рис. 2). Поэтому смешивание гистонов и ДНК in vitro при физиологической концентрации соли ведет к быстрому образованию нерастворимых и неструктурированных агрегатов. Шапероны, участвующие в формировании нуклеосом, несут отрицательный заряд и способны экранировать определенные поверхности гистонов, предотвращая их неспецифическое слипание с ДНК.
Рисунок 2. Рон Ласкей — ученый, впервые назвавший «молекулярными шаперонами» белки, необходимые гистонам для образования правильной структуры хроматина
FACT — шаперон гистонов с особыми функциями
FACT (от англ. facilitates chromatin transcription) так называется в честь первой функции, которая была для него показана в лаборатории Денни Рейнберга в конце двадцатого века. А именно, этот фактор облегчал считывание РНК с матрицы ДНК, упакованной в хроматин. Поэтому ему и дали имя, которое переводится как «усиливающий транскрипцию хроматина». На самом деле связь данного белкового комплекса с другим клеточным процессом — с удвоением генома перед делением клетки — была показана еще на год раньше Тимом Формозой в опытах с дрожжами, но зачётно назвать фактор он не сумел, и методы у него были скучные, поэтому название осталось за Рейнбергом.
Специфика методов Формозы также не дала ему констатировать 15 лет назад еще одно свойство FACT: оказывается, дрожжевой белковый комплекс может обратимо раскручивать нуклеосому — он берет и разводит витки нуклеосомной ДНК. И ему для этого ничего не нужно, кроме избытка одной из субъединиц (считается, что дрожжевой FACT (yFACT) состоит из трех белков: Spt16, Pob3 и Nhp6). Когда образуется комплекс yFACT—нуклеосома, то катушка практически полностью распрямляется, но все ее составляющие в виде ДНК и гистонов остаются связанными. Если убрать FACT из комплекса, то всё возвращается на круги своя: нуклеосомная ДНК снова наматывается на основание из гистонов. Данная активность шаперона была показана российско-американским коллективом соавторов под руководством профессора медицинского центра Fox Chase Василия Студитского и профессора кафедры биоинженерии МГУ им. Ломоносова Алексея Феованова.
Методы
Для того чтобы анализировать изменения в структуре нуклеосом, изучали флуоресценцию от единичных молекул и молекулярных комплексов в растворе. И вот как это происходит: в соседние витки нуклеосомной ДНК вводили флуоресцентые метки, одна из которых служит донором энергии, вторая — акцептором. Донор можно возбудить с помощью лазера определенной длины волны, и энергия возбуждения перейдет к акцептору. Но не всегда, а только в том случае, если он находится близко — значительно ближе, чем длина волны излучения донора. Такое взаимодействие между донором и акцептором называется фёрстеровским резонансным переносом энергии (FRET, Förster resonance energy transfer), который тем эффективней, чем ближе акцептор к донору. Таким образом, анализируя спектры флуоресценции, можно сказать, близко ли находятся друг к другу витки нуклеосомной ДНК или далеко. Также пары меток можно расположить в разных местах нуклеосомной ДНК и проследить за изменениями конформации более подробно. Для исследования раскручивания нуклеосомы фактором FACT использовали три пары меток (рис. 3).
Рисунок 3. Исследование раскручивания нуклеосомы фактором FACT. а — Три разные позиции расположения флуоресцентных меток в нуклеосоме донора (зеленая звездочка) и акцептора (красная звездочка). б — Схема экспериментальной системы: измерялась эффективность FRET нуклеосом — свободных и связанных комплексом FACT. Высокая эффективность FRET говорит о том, что нуклеосомы скручены, низкая — раскручены.
Как именно выглядят раскрученные с помощью FACT нуклеосомы, пока неизвестно (рис. 4). Самым интересным в этом процессе является то, что он не требует затраты АТФ. Ведь чтобы перестроить хроматин, есть специальные машины — АТФ-зависимые комплексы ремоделирования. Они тратят очень много энергии для того, чтобы передвигать гистоновое основание нуклеосомы вдоль ДНК. А FACT может просто развернуть нуклеосомную ДНК. Возможно, такие процессы в клетке экономят энергию в тех случаях, когда хроматин нужно быстро изменить. Например, если требуется активировать какой-либо ген, и структура хроматина соответствующего участка ДНК должна перестроится. Ничего более конкретного пока сказать нельзя — вопрос недостаточно изучен. Однако известно, что FACT участвует в освобождении от нуклеосом промоторов генов при их активации, по-видимому, в сотрудничестве с АТФ-зависимыми факторами ремоделирования хроматина. Поэтому на данный момент раскручивание нуклеосом FACT’ом, скорее, ассоциируется с инициацией транскрипции, чем, например, с элонгацией.
Рисунок 4. Одна из возможных моделей раскручивания нуклеосом белковым комплексом FACT.
Почему FACT важно изучать
Изучать функции белкового комплекса FACT важно не только с научной, но и с медицинской точки зрения. Дело в том, что данного фактора часто очень много в опухолевых тканях. А в нормальных тканях обычно мало. Какую роль он выполняет в активно делящихся клетках? Вероятно, разные. Тем не менее важно понять их все. FACT является мишенью для противоопухолевых препаратов кураксинов, которые сейчас проходят клинические испытания. Эти вещества вызывают перераспределение комплекса в ядре — переводят его из свободного состояния в связанное с хроматином. Как они это делают? Почему это вызывает целый каскад молекулярных процессов, который в итоге приводит к гибели делящихся клеток? С этими вопросами еще предстоит разобраться.
Источник: БИОМОЛЕКУЛА
