Микроб Deinococcus radiodurans был открыт в 1956 году. Его обнаружили в банке с мясом, которое было простерилизовано чудовищной дозой рентгеновского излучения, но всё равно испортилось. Его близкий родственник Deinococcus geothermalis (на снимке) тоже не боится ни радиации, ни высыхания.
Уникальная способность микроба Deinococcus radiodurans переносить огромные дозы радиации основана на высокоэффективной системе репарации (починки) ДНК. Микроб может «починить» свои четыре хромосомы даже после того, как ионизирующее излучение разорвет их на сотни обрывков. Как ему это удается, долгое время оставалось загадкой. И вот наконец принцип работы репарационной системы дейнококка расшифрован.
Радиоустойчивость дейнококка поистине поразительна. Дейнококк прекрасно себя чувствует после дозы радиации в 5000 Грей (1 Грей = 1 Джоуль на 1 кг живого веса), и даже втрое большая доза убивает лишь 2/3 клеток в колонии, в то время как смертельная доза для человека — 10 Грей, для кишечной палочки — 60 Грей. Дейнококк легко переносит высыхание и не погибает даже в вакууме.
По всей видимости, устойчивость микроба к радиации — это своеобразный побочный продукт приспособления к жизни в засушливых условиях (например, в пустыне). Самая большая неприятность, которая происходит с живой клеткой под воздействием радиации или высыхания, — это разрывы, возникающие в двойной спирали ДНК. Геном клетки попросту рвется на куски, что и приводит к летальному исходу.
Дейнококк способен «залечивать» до 1000 таких разрывов единовременно. Как ему это удается, оставалось загадкой в течение 50 лет — с момента открытия микроба и до 27 сентября 2006 года, когда на сайте журналаNature была опубликована статья французских и хорватских микробиологов, разгадавших эту загадку (правда, пока лишь в общих чертах).
Геном дейнококка состоит из четырех кольцевых молекул ДНК (размером 2,65, 0,41, 0,18 и 0,05 млн пар оснований), причем в каждой клетке геном присутствует не в одной (как у большинства бактерий), а в нескольких копиях.
Исследователи облучали колонии дейнококка гамма-лучами (доза 7000 Грей), в результате чего геном бактерии разрывался на сотни фрагментов длиной по 20-30 тысяч пар оснований (в среднем). Процессы, происходящие после этого в клетках дейнококка, изучались при помощи целого комплекса разнообразных методов. Например, скорость синтеза ДНК измерялась путем добавления в среду меченых нуклеотидов (3H-тимидин). Чтобы отличить «старые» фрагменты ДНК от новых, синтезированных уже после облучения, использовался аналог тимидина — 5-бромодеоксиуридин, включение которого в ДНК создает в молекуле «хрупкие» участки, которые рвутся под действием ультрафиолета. Последний метод, например, позволил установить, что объединение обрывков генома осуществляется благодаря тому, что между соединяемыми фрагментами синтезируются de novo участки двойной спирали ДНК.
Чтобы выяснить, является ли синтез длинных одноцепочечных фрагментов ДНК необходимым этапом репарации, использовали меченые антитела к 5-бромодеоксиуридину, которые связываются с этим веществом, если оно находится в составе одноцепочечной ДНК, но не связываются с ним, если оно включено в двойную спираль. Применялись также и многие другие хитроумные методы, о которых невозможно рассказать в краткой заметке из-за их сложности и многочисленности.
Как выяснилось, первые полтора часа после облучения дейнококки пребывают как будто «в шоке». Синтез ДНК почти не идет. Ученые метафорически назвали это состояние «клинической смертью». Затем начинается очень интенсивный синтез ДНК, сопровождающийся быстрым «склеиванием» разрозненных фрагментов генома. Все или почти все синтезируемые de novo участки ДНК сначала являются одноцепочечными. Через 3 часа после облучения в клетках наблюдается максимальное количество одноцепочечных фрагментов ДНК. В течение последующих трех часов одноцепочечные участки постепенно исчезают, замещаясь двухцепочечными. Через 6 часов после облучения геном оказывается практически полностью восстановленным в своем изначальном виде.
Общая схема процесса восстановления разорванных хромосом у дейнококка. Кольцевые хромосомы рвутся на кусочки под воздействием радиации или высыхания (DSB — разрывы двойной спирали). У двухцепочечных обрывков образуются короткие одноцепочечные хвосты (1). Этого может оказаться достаточно, чтобы фрагменты склеились между собой (4, 5). В противном случае происходит достраивание одноцепочечных хвостов, причем другие двухцепочечные обрывки ДНК используются в качестве матрицы (2, 3). Это продолжается до тех пор, пока каждый фрагмент не найдет себе «пару», то есть другой фрагмент с комплементарным одноцепочечным хвостом, и не склеится с ним (5). Из получившихся крупных линейных фрагментов собираются кольцевые хромосомы (b). Это происходит на основе механизмов гомологичной рекомбинации (HR).
Хотя многие детали процесса остаются еще неясными, исследователям удалось реконструировать его основные этапы. Сначала у обрывков двухцепочечной ДНК образуются короткие одноцепочечные хвосты. Для этого удаляется несколько концевых нуклеотидов на одной из двух цепей. Затем эти короткие одноцепочечные хвосты достраиваются и удлиняются. Матрицей для синтеза длинных «продолжений» одноцепочечных хвостов служат другие двухцепочечные обрывки ДНК.
Необходимым условием является наличие в каждой клетке дейнококка нескольких копий генома, которые под воздействием радиации рвутся в разных местах. Например, если есть три обрывка: ABCD, DEFG и GHIJ, то второй из этих обрывков может служить матрицей для достраивания к первому обрывку одноцепочечного хвоста –E, –EF или –EFG, а к третьему обрывку на той же матрице можно достроить одноцепочечный хвост F–,EF– или DEF–.
Этот этап репарации уникален для дейнококка. У других бактерий подобные механизмы неизвестны.По-видимому, именно синтез длинных одноцепочечных «хвостов» и позволяет собрать хромосомы заново из очень коротких обрывков, в то время как другие бактерии способны «залечивать» лишь единичные разрывы в своих хромосомах.
На следующем этапе фрагменты с гомологичными одноцепочечными хвостами слипаются друг с другом по принципу комплементарности. Так, в нашем примере могут «склеиться» друг с другом фрагменты с одноцепочечными хвостами –Е и EF–. После этого на той части «соединительного» участка EF, которая осталась одноцепочечной (в нашем случае F), специальные ферменты достраивают вторую комплементарную цепь. Если после склеивания остаются «лишние» торчащие одноцепочечные хвостики, они обрезаются ферментами — нуклеазами. В итоге получается длинный восстановленный фрагмент двухцепочечной ДНК (ABCDEFGHIJ).
Следующий, заключительный этап починки генома — это сборка кольцевых хромосом из получившихся длинных линейных двухцепочечных фрагментов. При этом используется имеющаяся у большинства бактерий молекулярная машина гомологичной рекомбинации. Гомологичные участки двухцепочечной ДНК (в данном случае — просто одинаковые, идентичные участки), присутствующие на разных линейных фрагментах, сближаются и образуют крестообразные соединения. Лишние концы обрезаются, и в конце концов восстанавливаются исходные кольцевые хромосомы.
Авторы отмечают, что расшифровка уникального механизма восстановления разорванных хромосом дейнококка, возможно, поможет разработать методы повышения устойчивости и продления жизни других клеток, в особенности неделящихся — например, нейронов головного мозга.
Источник: ЭЛЕМЕНТЫ БОЛЬШОЙ НАУКИ
