Объединённая команда немецких учёных из научных центров Гамбурга и Дрездена продолжает совершенствовать и модифицировать один из методов генной терапии ВИЧ, предложенный ранее. Теперь от экспериментов на клеточных культурах исследователи перешли к опытам на мышах со своим новым препаратом.
Принцип действия рекомбиназы Cre.
Существующие лекарства сдерживают распространение ВИЧ, но не способны полностью вылечить пациента, поэтому требуют пожизненного приёма. Поскольку они недёшевы, обладают побочными эффектами и не всегда помогают, потребность в эрадикации (то есть полном удалении) вируса велика. Две основные проблемы эрадикации вируса — это его изменчивость и наличие резервуаров латентной («спящей») инфекции — главным образом, в Т-лимфоцитах памяти, но также и в центральной нервной системе и других органах.
Немецкие исследователи создают уникальный метод терапии, направленный на решение первой проблемы. Своей мишенью они выбрали не белки вируса, а наиболее консервативные регуляторные последовательности вирусного генома. Методом направленной молекулярной эволюции они изменили фермент рекомбиназу Cre из бактериофага (бактериофаг — вирус, поражающий бактерию) так, чтобы эта рекомбиназа была специфична к широкому спектру штаммов ВИЧ-1. Рекомбиназа избирательно вырезает последовательности ВИЧ из хромосом тех клеток, где присутствует её ген.
Предыдущая версия рекомбиназы была специфична только к небольшой доле разновидностей ВИЧ (менее 1%). Новая разновидность, полученная в течение 145 циклов эволюции — предположительно — к 72% разновидностей.
Далее предполагается отбирать у ВИЧ-пациента гемопоэтические (кроветворные) стволовые клетки и вставлять ген рекомбиназы в их хромосомы методом лентивирусной доставки.
Лентивирусный вектор (средство доставки гена) представляет собой модифицированный вариант всё того же ВИЧ, способный доставить нужный ген в геном целевой клетки, но не способный к дальнейшему размножению (самоинактивирующийся). Кроме того, конструкция, созданная немецкими учёными, способна к экспрессии рекомбиназы только в клетках, заражённых ВИЧ, что увеличивает безопасность подхода.
Затем стволовые клетки должны вводиться обратно пациенту и порождать популяцию лимфоцитов, неуязвимую для ВИЧ, так как в случае заражения рекомбиназа, постоянно экспрессирующаяся в лимфоците, вырежет вирусные последовательности из генома клетки.
Перспективная схема терапии ВИЧ+ пациентов.
В активной разработке находится ряд других методов генной терапии ВИЧ, но большинство из них направлено на модификацию рецепторов, через которые вирус попадает в клетку (CCR5, CXCR4). Разработчики отмечают, что их подход более перспективен, так как ВИЧ может выработать способы обхода модификации рецепторов. Кроме того, подход разработчиков потенциально более безопасен, чем используемые другими учёными средства редактирования генома ZFN, TALEN или CRISPR/Cas9. Однако авторы отмечают возможность сочетания своего подхода с другими методами генной терапии.
С использованием улучшенной рекомбиназы Brec1 учёные продемонстрировали удаление последовательностей ВИЧ из клеток, взятых от пациентов, и повышение выживаемости этих клеток. Также была показана безопасность для клеточных культур человека и для мышей. Затем мышам с удалённой иммунной системой вводили заражённые лимфоциты человека, обработанные лентивирусным вектором, несущим рекомбиназу (у контрольных животных — без рекомбиназы). Через 18 недель в экспериментальной группе, в отличие от контрольной, наблюдалось полное отсутствие вирусной РНК. В следующем эксперименте мышам без иммунной системы вводили гемопоэтические стволовые клетки человека, обработанные лентивирусом, как в предыдущем эксперименте. После приживления клеток вводили ВИЧ и через 12 недель наблюдали полное отсутствие вирусной РНК в экспериментальной группе.
Проведённая работа впечатляет красотой концепции и высоким методологическим уровнем. Интересно, что учёные использовали в своей разработке для борьбы с ВИЧ подходы, которые применяет сам ВИЧ — молекулярную эволюцию, рекомбиназную активность, специфичность действия. Однако прежде чем этот подход станет применяться у людей, разработчикам предстоит преодолеть множество препятствий и снять риски, которые могут остановить разработку. В частности, мышиная модель не слишком релевантна по отношению к человеческой ВИЧ-инфекции: слишком много различий в иммунологических механизмах и вообще в физиологии. Даже подходы, которые сработали на обезьянах, не показали эффективности у человека. Основным опасением здесь является удивительная способность ВИЧ быстро эволюционировать, мутировать и уходить от терапевтического воздействия.
Также пока невысока эффективность модификации клеток лентивирусным вектором и их последующего приживления в организме пациента. Остаются вопросы и по безопасности: и лентивирусные векторы, и сама рекомбиназа могут оказаться генотоксичными у некоторых пациентов, то есть вызвать онкологическую трансформацию клеток. Сами авторы отмечают, что их подход не снимает проблему резервуаров латентного вируса, (пока рекомбиназа вводится только в отобранные у пациента клетки, а в покоящиеся клетки, содержащие «спящий» вирус, — не попадает), поэтому для полной эрадикации будет необходимо сочетать новый метод с другими подходами, способными «разбудить» спящий вирус. В перспективе учёные надеются разработать такие векторы, которые позволят вводить терапию прямо в организм пациента, минуя стадию отбора клеток.
Источник: XX2 ВЕК
