В состав выпечки, шоколадных батончиков и многих других привычных продуктов входит пальмовое масло. Его производят из плодов масличных пальм, выращивание которых вносит серьезный вклад в экономику нескольких азиатских стран. Огромное количество саженцев для заполнения плантаций получают клонированием родительских растений. Однако клоны нередко оказываются дефектными и дают плоды с пониженным содержанием масла. Исследователи выяснили, что причина такого нарушения кроется в метилировании ДНК масличных пальм. Снижение метилирования мобильного элемента Karma сказывается на работе гена EgDEF1, в котором он расположен. Этот ген участвует в формировании плода растения. Karma, а вернее, ее метилирование, определяет качество пальм. Теперь не нужно несколько лет ждать первых плодов, чтобы оценить их. Достаточно проверить Karma.
Плоды масличной пальмы — источник пальмового масла и скандалов в сми.
Растение особой важности
Масличная пальма стала важнейшим сельскохозяйственным растением. Из ее плодов получают пальмовое масло, входящее в состав огромного количества продуктов. Половина всего потребляемого растительного масла в мире — пальмовое. Получать этот продукт гораздо дешевле, чем его главного конкурента — масло сливочное. Если рассуждать о пользе, то в пальмовом масле содержится меньше насыщенных жиров, чем в сливочном. А транс-жиров, потребление которых ассоциировано с развитием атеросклероза, в нём нет совсем. Во многих странах пальмовые плантации вносят серьезный вклад в экономику. Хотя родина масличной пальмы — Африка, ее выращивание налажено и в других частях света. Лидируют в этом направлении Индонезия и Малайзия. Пальма — наиболее эффективный источник масла среди всех растительных культур. Ценный продукт получают из плодов размером со сливу, собранных в большие грозди (рис. 1): масло содержится в семени и околоплоднике. Запрос на этот продукт постоянно растет. В последнее время его начали использовать даже для получения биотоплива. В странах, культивирующих масличную пальму, из-за постоянной потребности в расширении плантаций существует проблема обширной вырубки лесов. Эти обстоятельства подталкивают владельцев пальмовых плантаций к получению сортов растения с увеличенным содержанием масла в плодах и к рациональному использованию территорий.
Рисунок 1. Рабочий в Малайзии занимается сбором плодов масличной пальмы.
Трудности с размножением
Селекция сортов масличных пальм, используемых сегодня, имеет интересную историю. Одомашнивание африканской масличной пальмы (Elaeis guineensis) началось с обнаружения формы растения, плоды которой лишены толстой оболочки (оболочка у плодов дикого варианта похожа на толстую корку плода кокосовой пальмы). Еще одним важным шагом стало получение на основе разных сортов масличной пальмы нового гибрида — tenera. Этот гибрид дает на 30% больше масла, чем родительские сорта, однако его трудно размножать. Показано, что высокая продуктивность tenera обеспечена уникальным вариантом гена SHELL, участвующего в формировании плода. Диплоидный геном гибрида содержит две копии гена SHELL — по одной от каждого родителя. У tenera одна копия этого гена — дикого типа, а вторая — «высокопродуктивная». Именно при таком сочетании достигается большой выход масла из плодов. При скрещивании растений tenera друг с другом у потомства «дикий» и «высокопродуктивный» варианты гена перемешиваются. Многие растения в потомстве получают две одинаковые копии. Такие пальмы будут давать меньше масла. Эта трудность с размножением гибридов широко распространена в сельском хозяйстве. Их нельзя переопылять для размножения половым путем, поэтому такие растения размножают вегетативно. Правда, пальма не размножается черенками, как, например, куст смородины. Для этого используют микроклональное размножение.
Этот метод позволяет из тканей одного взрослого растения вырастить тысячи новых, генетически идентичных родительскому. Фрагменты листа пальмы, содержащие тотипотентные клетки, выращивают в присутствии растительных гормонов. Тотипотентные клетки могут дать начало клеткам любой ткани, и в таких условиях из них формируется проросток, после пересадки развивающийся в полноценную масличную пальму. Размножение пальм для плантаций в Восточной Азии сегодня ведется именно таким способом. Полная генетическая идентичность пальм должна обеспечивать высокий выход масла у каждой из них. Однако это не всегда так. У взрослых масличных пальм, полученных микроклональным способом, часто развиваются цветки с неправильным строением (рис. 2).
Рисунок 2. Плоды нормальных и дефектных пальм. Сверху вниз: общие фотографии плодов, фото продольного среза и снимок поперечного среза плода. Белой стрелкой обозначены ядра плодов, черной стрелкой — ложные плодолистики. а — Нормальные плоды. б — Плоды из фертильных дефектных цветков. в — Плоды из дефектных цветков, образовавшиеся без оплодотворения.
Тычинки мужских цветков и пестики женских у таких растений превращены в ложные плодолистики. По этой причине мужские цветки становятся стерильными. Женские могут сохранять фертильность, но после оплодотворения дают плод, несущий меньше масла (рис. 2б). Часто такие цветки начинают формировать плод и вовсе без оплодотворения — тогда в нём отсутствует ядро, наиболее богатое маслом (рис. 2в). Масличная пальма начинает плодоносить только через 3-4 года после посадки, а аномально развивается, как правило, большинство цветков растения. Таким образом, эти нарушения можно выявить не сразу, потому подобный сбой микроклонального размножения является серьезной экономической проблемой. И до сих пор не ясно, как ее можно решить.
Улики
Пальмы с дефектными цветками генетически идентичны родительскому растению. Это значит, что причина нарушения кроется не в мутациях каких-либо важных генов. К тому же скрещивания дефектных пальм показали, что этот признак наследуется не по законам Менделя. Соответственно, его причина кроется не в последовательности нуклеотидов ДНК. Такие особенности наследования характерны для свойств организма, определяемых эпигенетически. Эпигенетика подразумевает ряд механизмов наследования, не связанных с первичной структурой хромосомной ДНК. Эти механизмы позволяют включить или выключить ген, изменив его окружение. Например, могут быть модифицированы белки, служащие для упаковки ДНК. Такие белки — гистоны — могут нести ряд меток, определяющих статус активности генов. Еще один распространенный механизм эпигенетической регуляции — метилирование ДНК. ДНК состоит из звеньев четырех типов, различающихся азотистыми основаниями. Всего их четыре: аденин, тимин, гуанин и цитозин. Четыре «буквы», которыми написаны все геномы. Часто причиной какого-то дефекта является замена букв либо их «выпадение». При метилировании порядок букв остается неизменным, но на одну из них — цитозин — помещается метильная группа (рис. 3). Как правило, метилироваться могут цитозины на протяженных участках ДНК. Обычно такая модификация связана с выключением генов и снижением их доступности для белков, способных их снова включить.
Рисунок 3. Схема метилирования цитозина
Метилирование ДНК — распространенное явление. Организмы от кукурузы до человека используют его не только при выключении генов, но и для защиты от мобильных элементов генома. Эти элементы — последовательности ДНК, способные перемещаться между участками генома, обычно увеличивая при этом число своих копий. Но если ДНК мобильного элемента метилирована, он не способен к перемещениям. Известно много примеров, когда вышедшие из-под контроля мобильные элементы вызывают нарушения в геноме, отражающиеся на внешнем виде растения. Один из таких примеров — кукуруза с разноцветными зернами, ставшая известной благодаря работам Барбары Мак-Клинток, открывшей мобильные элементы. Часто элементу даже не нужно перемещаться в ген, чтобы нарушить его работу. Изменения в метилировании мобильного элемента могут повлиять на работу ближайшего гена. Эти обстоятельства давно заставили исследователей предположить, что дефекты плодов масличных пальм могут быть связаны с активностью мобильных элементов, вызванной нарушением метилирования. Дело в том, что метилирование ДНК у растений, полученных микроклональным способом, значительно снижено. Но как найти то самое — связанное с дефектами строения цветков — место в геноме?
Большой скрининг
Поиск геномного участка, связанного с дефектом плодов у пальмы, безуспешно длился годами. Вначале предполагалось, что причиной может быть нарушение метилирования какого-то гена. Хороший кандидат на эту роль — ген транскрипционного фактора EgDEF1. Он входит в семейство гомеозисных генов. Нарушения в их структуре приводят к трансформации одних частей растений в другие. Как раз тот случай — ведь у дефектных пальм пестики и тычинки превращены в ложные плодолистики. У растения Arabidopsis мутации в гене EgDEF1 вызывают очень похожие нарушения в строении цветков. Однако метилирование EgDEF1 у дефектных пальм оказалось неизменным. Вблизи этого гена есть два мобильных элемента. Возможно, дело в них? Подробный анализ их метилирования не выявил разницы между растениями с измененными плодами и нормальными.
Работа большого международного коллектива ученых из Малайзии и США началась с полногеномного анализа метилирования ДНК нормальных пальм и растений с дефектными плодами. Результаты этой работы опубликованы в недавнем выпуске журнала Nature. Авторы задались целью вычислить то место генома, где уровень метилирования различается у нормальных и дефектных пальм. Это нелегкая задача. Метилирование генома двух нормальных растений ужé значительно различается. Чтобы вычислить уникальные для дефектных пальм отличия, анализировали около сотни растений. В частности, отобрали растения из популяции, давшей начало пальмам-клонам при размножении, и сами клоны — с нормальными и дефектными плодами. Размер генома пальмы — около 1,8 миллиарда букв. Метилирование оценивали для участков размером 1-2 тысячи букв. Очевидно, что результат такого эксперимента — очень большой набор данных. Были обнаружены десятки тысяч различий в метилировании ДНК между нормальными и аномальными растениями. Однако 99,9% этих различий встречались и внутри выборки нормальных пальм. Удивительно, но значимым оказалось только одно различие — в метилировании короткого участка внутри гена EgDEF1.
Всё решает Karma
У дефектных пальм метилирование одного из участков гена EgDEF1 практически отсутствует, хотя у нормальных пальм этот фрагмент содержит много метильных меток. Подробный анализ показал, что в нём расположен незамеченный ранее мобильный элемент. Его последовательность похожа на элемент Karma, обнаруженный у риса. Известно, что Karma может эффективно перемещаться в геноме растений риса, полученных микроклональным путем. У таких растений уровень метилирования ДНК снижен, соответственно, контроль над мобильными элементами ослаблен. Авторы работы проанализировали еще несколько десятков пальм и подтвердили связь метилирования нового мобильного элемента с нарушениями в строении плодов. Статус Karma, таким образом, хорошо предсказывает качество пальмы. Поэтому исследователи решили назвать мобильный элемент с пониженным метилированием «плохая Karma». Можно не ходить к специалисту, чтобы понять, что «хорошая Karma» сильно метилирована. По-видимому, этого эпигенетического изменения достаточно, чтобы испортить плоды, и перемещения мобильного элемента для этого не нужно. Но тогда как он влияет на ген EgDEF1?
Исследователи проанализировали транскрипцию гена EgDEF1 у нормальных и дефектных пальм. Полногеномный анализ транскриптов масличной пальмы выявил две формы РНК, синтезирующихся на основе этого гена: длинную cDEF1 и короткую tDEF1 (рис. 4). Только эти транскрипты EgDEF1 обнаруживают у нормальных растений. Обе РНК подвергаются сплайсингу: происходит вырезание большей части транскрипта (РНК разрезается в особых местах — сайтах сплайсинга), а оставшиеся фрагменты сшиваются вместе. Итоговая матричная РНК используется для белкового синтеза. У дефектных пальм авторы обнаружили еще один укороченный транскрипт гена EgDEF1 — его назвали kDEF1. Эта короткая форма образуется в результате остановки транскрипции внутри мобильного элемента Karma. Такой транскрипт в ходе трансляции даст начало новому варианту белка EgDEF1. Можно ожидать, что такой дефектный транскрипционный фактор в итоге вызовет аномалии в развитии плодов.
Рисунок 4. Транскрипты гена EgDEF1. Вверху на схеме приведены геномные координаты. Цветными прямоугольниками обозначены два мобильных элемента — Karma и Koala. Ниже горизонтальными линиями показаны транскрипты EgDEF1, вертикальные черточки на которых — экзоны, остающиеся в мРНК после сплайсинга.
Но не только малый размер транскрипта kDEF1 делает его особенным. Элемент Karma содержит внутри своей последовательности ген обратной транскриптазы, необходимой для размножения элемента. Этот ген внутри Karma EgDEF1 поврежден, но не удален полностью. И, как оказалось, влияет на сплайсинг: в нём содержится сайт для сплайсинга, который используется в транскрипте kDEF1 (рис. 4). По этой причине образуется не просто укороченный вариант белка EgDEF1, а белок с измененной структурой. Ведь его концевой фрагмент транслируется с последовательности мобильного элемента.
Почему же РНК kDEF1 появляется только у дефектных растений? По-видимому, это связано с пониженным метилированием Karma. Известно, что метилирование сайтов сплайсинга влияет на их использование. «Хорошая Karma» сильно метилирована, и сайт сплайсинга в составе этого элемента неактивен. Пока неизвестно, действительно ли дефектный белок EgDEF1 вызывает нарушение в развитии плодов. Прямые эксперименты, чтобы это показать, не проводились. Однако четкая связь между метилированием Karma, синтезом дополнительного транскрипта kDEF1 и неправильным развитием плодов говорит в пользу этого.
Один из главных результатов работы — появление способа распознавать дефектные растения до их посадки. Достаточно проанализировать метилирование Karma у клонально полученных пальм. Это дает надежду на то, что меньше лесов будет вырублено ради размножения масличных пальм, а существующие плантации станут использоваться эффективнее. Эта работа показывает красивый пример применения глубоких научных знаний в решении прикладной задачи. Благодаря открытиям недавнего времени, появилась возможность окончательно разобраться в прежде «неприступных» вопросах. Над проблемой дефектных плодов у клональных пальм бились несколько десятилетий и наконец получили обнадеживающие результаты. Возможно, вскоре удастся преодолеть и другие затруднения: эпигенетика вслед за классической генетикой становится свободным полем для работы биотехнологов.
Источник: БИОМОЛЕКУЛА
