Рис. 1. Скорость мутагенеза у разных организмов. По вертикальной оси — темп нуклеотидных замен (на миллиард пар оснований за поколение), по горизонтальной — размер генома (в миллионах пар оснований). Левый график — вирусы и прокариоты, правый — эукариоты (на правом графике также показаны усредненные значения для бактерий и архей). Красная линия соответствует уровню мутагенеза, равному одной мутации на геном за поколение. Видно, что у вирусов и прокариот чем больше геном, тем ниже темп мутагенеза, тогда как у эукариот наблюдается обратная зависимость. Видно также, что млекопитающие характеризуются экстремально высоким числом мутаций на геном за поколение. Eubacteria — бактерии, Archaea — археи, Double-stranded DNA viruses, Single-stranded DNA viruses — вирусы, содержащие дву- и однонитевую ДНК, RNA viruses — РНК-содержащие вирусы, Mammals — млекопитающие, Invertebrates — беспозвоночные, Plant — растение, Unicellular eukaryotes — одноклеточные эукариоты.

За 15 лет, прошедших со времени первого чернового прочтения человеческого генома, наши знания о мутациях, то и дело возникающих в наших генах, многократно увеличились, а методы их изучения стали намного эффективнее и разнообразнее. В обзорной статье американских генетиков, опубликованной в журнале Science, подводятся итоги изучения мутационного процесса у Homo sapiens за первые полтора десятилетия «геномной эры».

Мутагенез — одно из самых фундаментальных биологических явлений. Все без исключения живые существа подвержены мутациям. Случайные изменения в последовательности нуклеотидов ДНК возникают как во время репликации (размножения) молекул ДНК, так и в промежутках между актами репликации (например, под действием ультрафиолетового излучения и других мутагенов). Большинство мутаций сразу исправляется специальными системами починки (репарации) ДНК, но даже самые сложные и совершенные системы репарации не обеспечивают стопроцентную защиту.

Темп мутагенеза сильно различается у разных организмов, однако ни у одного существа — от вирусов до человека — он не равен нулю. Этот факт может показаться тривиальным, но на самом деле он требует объяснений, и вот почему.

Как правило, среди ненейтральных (влияющих на приспособленность) мутаций гораздо больше вредных, чем полезных. Так получается по чисто вероятностным причинам (см. Принцип Анны Карениной). Следовательно, чем ниже темп мутагенеза, тем выше, при прочих равных, будет средняя приспособленность потомков данного организма. Поэтому отбор, казалось бы, всегда должен способствовать снижению темпов мутагенеза: под его действием должны развиваться всё более точные системы репликации и репарации. Почему же эти системы так и не стали абсолютно безошибочными?

Причин, скорее всего, две. Первую можно условно назвать «экономической». Сверхточные системы репликации и репарации, скорее всего, были бы слишком дороги: громоздки, энергоёмки, их работа замедляла бы репликацию или имела какие-то другие вредные побочные эффекты. К тому же чем точнее работают эти системы, тем слабее давление отбора, направленного на их дальнейшее усовершенствование.

Вторая причина состоит, конечно же, в том, что полезные мутации тоже нет-нет, да и происходят. Поэтому, хотя средняя приспособленность потомков мутирующих организмов всегда будет ниже, чем у немутирующих, разброс приспособленности и максимальная приспособленность у первых будут выше. Поэтому во многих ситуациях, особенно при изменениях среды, явное преимущество будет на стороне мутирующих организмов не только в долгосрочной перспективе (тысячи и миллионы лет), но и в краткосрочной (в масштабе одного или нескольких поколений). Для некоторых организмов прямой вред слишком медленного мутирования удалось показать экспериментально.

Так или иначе, мутации неизбежны, вредных среди них гораздо больше, чем полезных, и всему живому приходится с этим мириться (и, более того, к этому приспосабливаться). Мы, люди, не только не являемся исключением, но даже, вместе с остальными млекопитающими, сильно опережаем большинство живых существ по темпам мутагенеза в расчете на особь за поколение (рис. 1).

Геном Homo sapiens впервые был вчерне прочтен около 15 лет назад. С этого момента началась новая эра в изучении мутационного процесса у нашего вида. Благодаря стремительному развитию технологий секвенирования и анализа геномных последовательностей сегодня мы знаем неизмеримо больше, чем в начале XXI века, о темпе мутаций, о закономерностях их распределения по геному, об их роли в различных патологиях (включая рак) и о других особенностях нашего мутагенеза, имеющих как теоретическое, так и практическое значение.

В свежем выпуске журнала Science опубликована подборка статей, посвященных этой животрепещущей теме. Большинство из них касаются узкоспециальных, в том числе медицинских вопросов, но в одной, написанной генетиками из Вашингтонского университета в Сиэтле, дан общий обзор того, что мы узнали о своих мутациях за последние 10–15 лет.

1. Темп мутаций «зародышевой линии». Все мутации можно подразделить на соматические (происходящие в соматических, то есть не половых клетках организма на разных стадиях развития) и мутации «зародышевой линии» (germline mutations), меняющие геном половых клеток и передающиеся по наследству потомкам. С медицинской точки зрения крайне важны оба типа мутаций, с эволюционной — вторые, конечно, важнее.

Первые оценки скорости возникновения мутаций в зародышевой линии у человека были сделаны задолго до геномной эры, однако их точность была невелика. Сегодня для этого используют несколько подходов. Один из них — изучение родословных с целью подсчета вновь возникающих мутаций с четким фенотипическим эффектом и высокой пенетрантностью (то есть таких мутаций, которые меняют фенотип, во-первых, строго определенным образом, во-вторых — наверняка). Как правило, для этого используют мутации, вызывающие врожденные патологии — «менделевские» (наследующиеся в соответствии с законами Менделя) наследственные болезни. Они наследуются по Менделю, потому что вызываются единичными мутациями, а не хитрыми комбинациями десятков и сотен «аллелей риска» в сочетании с факторами среды. В одном из недавних исследований, основанных на этом подходе, темп однонуклеотидных замен у людей был оценен в 1,28 мутаций на 100 млн пар оснований за поколение (1,28 × 10–8 на нуклеотид за поколение). Поскольку в диплоидном геноме человека примерно 6 млрд пар оснований, это соответствует 77 новым мутациям на геном за поколение.

Другой подход основан на сравнении геномов человека и других приматов. Подсчитав различия в нейтральных (не находящихся под действием отбора) участках генома, можно сопоставить полученный результат со временем жизни последнего общего предка сравниваемых видов (насколько его можно оценить по палеонтологическим данным). Согласно нейтральной теории молекулярной эволюции, скорость накопления нейтральных генетических различий между видами в идеале должна быть просто-напросто равна скорости нейтрального мутагенеза (за одно поколение между двумя видами накапливается столько же различий, сколько новых мутаций возникает у каждой особи). Поэтому, зная время дивергенции, темп мутагенеза можно рассчитать по формуле m = D/2t, где D — число нейтральных различий между видами, t — время жизни последнего общего предка в «поколениях назад». Двойка в формуле появляется из-за того, что оба вида после расхождения накапливали мутации независимо друг от друга.

Впрочем, существует куча факторов, нарушающих правильный ход «молекулярных часов», да и палеонтологические датировки последних общих предков, мягко говоря, не всегда точны. Поэтому надежность данного метода невысока. Неудивительно, что результаты он дал несколько иные. Например, после прочтения генома шимпанзе темп нашего мутагенеза был оценен в 2,2 × 10–8 замен на нуклеотид за поколение, или 132 новых мутации у каждого новорожденного — почти вдвое больше, чем показал анализ наследственных болезней.

В последние годы благодаря резкому удешевлению полногеномного анализа появилась возможность оценивать темп мутагенеза напрямую, просто сравнивая геномы родителей с геномами их детей и подсчитывая новые мутации. Появились и другие подходы, в частности основанные на палеогенетических данных. Например, прочтение геномов неандертальцев и других древних людей позволило оценивать темп мутагенеза по числу «недостающих мутаций» в этих геномах, то есть по тому, насколько меньше генетических отличий от общего предка успела накопить линия, вымершая десятки тысяч лет назад, по сравнению с нами сегодняшними. Эти и другие новые методы дают оценки в диапазоне от 1,0 × 10–8 до 1,2 × 10–8 замен на нуклеотид за поколение, то есть 60–72 новых мутаций у каждого новорожденного. И это, по-видимому, близко к истине.

Конечно, это средние значения: у отдельных индивидов число новых мутаций может быть, как меньше, так и существенно больше среднего. В любом случае сомневаться не приходится: мы все — закоренелые мутанты! Далеко до нас всякой мелочи вроде бактерий или дрожжей, у которых одна-единственная новая мутация может приходиться на тысячу, а то и на десять тысяч «новорожденных» (клеточных делений) (рис. 1).

У млекопитающих «под отбором» находится 5–10% генома, а всё остальное — в основном мусор (выражаясь политкорректно, это области, все или почти все мутации в которых являются нейтральными, то есть не влияют на приспособленность и не подвергаются действию отбора). Следовательно, из 60–70 новых мутаций в геноме среднестатистического новорожденного примерно 3–7 являются вредными. Темп возникновения полезных мутаций точно не известен, но они наверняка достаточно редки, чтобы ими можно было пренебречь, говоря об одном среднестатистическом человеке.

От трех до семи новых вредных мутаций у каждого человека в каждом поколении — это угрожающе много. Нужен сильный очищающий отбор, чтобы избежать вырождения, то есть неуклонного накопления генетического груза (см. Genetic load). Если же на отбор надежда плохая, то остается надеяться только на высокие биотехнологии: генную инженерию, генную терапию, экстракорпоральное оплодотворение с искусственным отбором эмбрионов и тому подобное. Впрочем, об угрозе вырождения в обсуждаемой статье речь не идет (но эта проблема обсуждается в статьях, на которые ссылаются авторы обзора).

Кроме однонуклеотидных замен бывают еще вставки и выпадения («инделы», Indel), инверсии (повороты на 180°) и дупликации фрагментов ДНК разной длины. Такие мутации происходят реже, чем однонуклеотидные замены, зато они затрагивают большее число нуклеотидов и, конечно, тоже влияют на вероятность развития всевозможных болезней. По имеющимся оценкам, пока еще не очень точным, каждый человек несет в среднем около трех новых мелких (1–20 пар оснований) вставок и делеций и 0,16 более крупных (>20 пар оснований).

Зная темп мутагенеза, численность населения и рождаемость, можно примерно оценить общий масштаб генетического полиморфизма современного человечества. Масштаб этот впечатляет: только за время жизни одного последнего поколения в человеческой популяции должно было заново появиться более 1011 точечных мутаций — много больше, чем нуклеотидов в геноме! По-видимому, каждая возможная точечная мутация (кроме несовместимых с жизнью) имеется в данный момент как минимум у сотни-другой живущих на планете людей. Зарегистрированных полиморфизмов, разумеется, гораздо меньше, ведь до поголовного прочтения геномов дело еще не дошло.

2. Закономерности распределения мутаций по геному. Как известно, мутации случайны. По крайней мере, в первом приближении. Это, впрочем, не значит, что вероятность возникновения всех мутаций абсолютно одинакова или что процесс мутагенеза полностью хаотичен во всех своих аспектах. Под «случайностью» мутаций подразумевается вполне конкретная вещь, а именно отсутствие прямого влияния полезности или вредности мутации на вероятность ее возникновения. У живых существ нет механизма, позволяющего рассчитать, какая именно мутация будет им полезна в данных условиях, и внести именно эту мутацию в свой геном. Правда, есть механизмы, позволяющие несколько повысить вероятность появления полезных мутаций (пример — соматическое гипермутирование иммуноглобулиновых генов в лимфоцитах) и снизить вероятность появления вредных. В частности, оказалось, что частота мутирования у людей связана с временной последовательностью репликации хромосом. В участках, реплицирующихся раньше других, возникает меньше мутаций, чем в участках, реплицирующихся в последнюю очередь. Это выгодно, поскольку первыми, как правило, реплицируются участки, в которых много генов. Соответственно, мутации в этих регионах часто оказываются вредными. Последними же реплицируются участки ДНК, в которых преобладает «мусор» и в которых поэтому большинство мутаций оказываются нейтральными.

Наиболее сильный «перекос» в распределении мутаций в человеческом геноме состоит в том, что чаще всего мутируют нуклеотиды Ц (цитозины), за которыми следует нуклеотид Г (гуанин) (см. CpG site). Цитозин вообще является «слабым звеном» в ДНК, поскольку он склонен превращаться в урацил (У) в результате спонтанного деаминирования. Однако системы репарации бдительно следят за тем, чтобы никаких урацилов в ДНК не было, и быстро исправляют большинство возникших таким способом мутаций.

Динуклеотиды ЦГ отличаются тем, что входящие в их состав цитозины часто подвергаются метилированию. Метилированный цитозин в результате деаминирования превращается уже не в урацил, а в тимин — «законное» основание, в норме входящее в состав ДНК. Обнаружить такую мутацию системам репарации гораздо труднее.

В результате частота мутирования цитозинов в динуклеотидах ЦГ примерно в 10 раз выше нормы. Это, в свою очередь, приводит к неравной встречаемости аминокислотных замен. Из всех 20 аминокислот в человеческих белках самым «уязвимым» является аргинин. Как выяснилось, свыше 16% всех аминокислотных замен, приводящих к наследственным болезням, — это замены аргинина (рис. 2). Это факт, на первый взгляд загадочный, объясняется очень просто. Если посмотреть в таблицу генетического кода, то можно убедиться, что все 4 кодона, начинающиеся со склонного к мутациям динуклеотида ЦГ, кодируют именно аргинин.

Рис. 2. Относительная частота аминокислотных замен у человека. Рекордсменом по числу замен является аргинин (R), потому что 4 из 6 кодирующих его триплетов начинаются с динуклеотида ЦГ (данные основаны на анализе 4000 несинонимичных мутаций, вызывающих наследственные болезни). Рисунок из обсуждаемой статьи в Science.

В кодирующих последовательностях динуклеотидов ЦГ больше, чем в среднем по геному, что способствует более высокому темпу мутирования кодирующих последовательностей по сравнению с некодирующими. Впрочем, есть также механизм, снижающий частоту мутирования кодирующих последовательностей, по крайней мере тех, которые часто транскрибируются. Дело в том, что транскрибируемые последовательности подвергаются более качественной репарации (см. Transcription coupled repair). Из-за этого в генах, активных в клетках зародышевой линии, наследуемые мутации возникают реже, чем в среднем по геному.

Очевидно, что паттерн мутирования, как и другие признаки организма, вполне может эволюционировать под действием мутаций, отбора и дрейфа. Он может немного различаться не только у человека и шимпанзе, но даже у разных человеческих популяций. И это не только теория. Так, сравнительно недавно, от 40 до 80 тысяч лет назад, изменился паттерн мутирования у предков нынешних европейцев, которые тогда как раз отделились от предков азиатов. А именно, у европейцев повысился темп возникновения мутаций в тринуклеотидах ТЦЦ. Эти тринуклеотиды стали чаще превращаться в ТТЦ (5'-ТЦЦ-3' → 5'-ТТЦ-3').

Известно, что именно такие мутации чаще всего возникают в клетках кожи под действием ультрафиолета. Особенно характерны они для клеток меланомы. У европейцев кожа в ходе эволюции стала прозрачнее для ультрафиолета, чем у других человеческих популяций, поэтому учащение подобных мутаций в клетках кожи легко объяснимо. Но вот как эти мутации проникают в зародышевую линию, точно не известно. Одна из гипотетических возможностей состоит в том, что ультрафиолет повышает частоту мутаций данного типа и в коже, и в половых клетках одним и тем же косвенным путем, способствуя деградации фолиевой кислоты. Дефицит этого витамина может приводить к сбоям в ходе синтеза ДНК. Так или иначе, данный факт наглядно показывает, что паттерн мутирования в человеческих популяциях действительно подвержен эволюционным изменениям.

3. Немолодые отцы — главный источник наследственных мутаций. На сегодняшний день твердо установлено, что львиную долю новых наследственных мутаций люди получают от отцов. При этом чем старше мужчина, тем больше мутаций в его сперматозоидах. Около 95% вариабельности потомков по числу новых мутаций объясняется возрастом отца. Хуже того, оказалось, что у старых отцов сглаживается упомянутая выше зависимость частоты мутаций от последовательности репликации (replication timing). Соответственно, растет доля мутаций в «осмысленных» участках генома, а среди таких мутаций выше доля вредных.

С возрастом матери число мутаций в ее яйцеклетках не увеличивается, зато вероятность рождения детей с хромосомными нарушениями, такими как синдром Дауна, растет.

Короче говоря, заводить детей все-таки лучше в молодости. Наблюдающаяся в развитых странах тенденция к увеличению среднего возраста отцовства и материнства дополнительно усиливает риск генетического вырождения человечества.

4. Соматические мутации и их медицинское значение. За жизнь человека клетки его тела делятся триллионы раз. Каждое деление сопряжено с риском соматических мутаций, да и в промежутках между репликациями молекулы ДНК могут повреждаться. В тканях, клетки которых делятся особенно интенсивно (например, в кишечном эпителии), к 60 годам должна присутствовать, хотя бы в одной клетке, едва ли не каждая из всех возможных точечных мутаций. Разнообразие соматических мутаций выше, чем наследственных, потому что первым, чтобы не быть немедленно отбракованными отбором, достаточно быть совместимыми с жизнью всего-навсего одной клетки, тогда как вторым необходима совместимость с жизнью целого организма.

Хотя соматические мутации не передаются по наследству, их медицинское значение очень велико. Давно известно, что они играют ключевую роль в развитии различных видов рака. В последние годы стало ясно, что соматические мутации вызывают и многие другие заболевания. Например, выяснилось, что соматические мутации в генах PIK3CA, AKT3 и mTOR вызывают гемимегалэнцефалию — одностороннее увеличение и нарушение функции одного из полушарий мозга, которое к тому же повышает риск развития эпилепсии. Сравнительно небольшая доля мутантных клеток может нарушить работу обширных областей коры: у пациентов с дисфункцией целого полушария мутацию могут нести лишь от 8 до 35% клеток мозга. По-видимому, соматические мутации лежат в основе многих других патологий центральной нервной системы.

5. На пути к пониманию фенотипических эффектов мутаций. Конечной — и едва ли достижимой в обозримом будущем — целью изучения человеческих мутаций является создание их полного каталога с указанием влияния каждой мутации на фенотип. В идеале хорошо бы еще разобраться во взаимном влиянии эффектов разных мутаций друг на друга, но до полного каталога таких взаимодействий пока еще слишком далеко.

Эффекты мутаций изучают на трех уровнях, которые можно условно назвать молекулярным, медицинским и эволюционным. В первом случае речь идет о том, как та или иная мутация влияет на экспрессию гена или функцию белка. Во втором — о том, как мутация влияет на вероятность развития тех или иных заболеваний. В третьем — о влиянии мутаций на приспособленность (репродуктивный успех). Конечно, это взаимосвязанные вещи, но корреляции между ними не строгие. Например, мутации, вызывающие старческие болезни, вряд ли будут «вредными» с эволюционной точки зрения: они не скажутся на репродуктивном успехе. Ослабление функции какого-нибудь фермента может сказаться на здоровье человека в одних условиях среды, но никак не проявиться в других, и так далее. Все три типа исследований связаны с большими методологическими трудностями, поэтому пока мы имеем более или менее детальную информацию лишь по относительно небольшому числу мутаций.

Например, выяснение молекулярных эффектов мутаций — это чрезвычайно кропотливая работа, которую, однако, можно проводить в пробирке. В итоге, потратив неимоверное количество сил и средств, можно получить более или менее полный мутационно-функциональный спектр для какого-нибудь белка. На рис. 3 показаны результаты исследования влияния разных аминокислотных замен на убиквитин-лигазную функцию регуляторного белка BRCA1. Это белок, пришивая убиквитин к другим белкам, регулирует репарацию ДНК и играет важную роль в защите от рака.

Рис. 3. Рисунок показывает, как влияют на убиквитин-лигазную функцию BRCA1 аминокислотные замены в каждой из 103 аминокислотных позиций исследованного фрагмента белка. Аминокислотные позиции расположены вдоль горизонтальной оси и подписаны в нижней части диаграммы. Для каждой позиции разными цветами показаны эффекты разных замен. По вертикальной оси отложены 20 аминокислот, которыми исследователи поочередно заменяли исходную аминокислоту в каждой позиции. Желтыми прямоугольничками отмечены аминокислоты «дикого типа», то есть те, которые стоят в данной позиции в нормальном, не мутантном белке. Синий цвет обозначает ослабление функции, красный — ее усиление выше нормального уровня, белый — сохранение исходного уровня активности белка (см. цветовую шкалу справа; единица соответствует исходному состоянию, то есть «норме»). Наконец, серый цвет обозначает, что для данной замены данные не были получены. По количеству белых и почти белых прямоугольничков можно судить о толерантности данного белка к мутациям, то есть о спектре несинонимичных (ведущих к замене аминокислоты) мутаций, которые не приводят к драматическим изменениям его функциональности.

Данное исследование, с одной стороны, впечатляет своей грандиозностью, с другой — наводит на грустные мысли о том, сколько же сил нужно потратить, чтобы получить хотя бы такие простенькие, одношаговые «адаптивные ландшафты» для всех человеческих белков и всех единичных несинонимичных мутаций, не говоря уж об их комбинациях. Но тем не менее эта работа необходима, если мы хотим приблизиться к ответу на ключевой вопрос о соотношении генотипа и фенотипа.

Источник: ЭЛЕМЕНТЫ