Рис. 1. Схематические изображения теории пангенезиса Дарвина (А) и теории о барьере Вейсмана (Б).
Итальянские ученые решили проверить, могут ли приобретенные признаки передаваться потомству посредством прямого переноса от соматических к половым клеткам специфических молекул РНК. Для этого мышам подкожно трансплантировали клетки меланомы человека со встроенным геном зеленого флуоресцирующего белка. Ожидания были оправданы: молекулы РНК чужеродного гена, нарабатывающиеся в трансплантированных клетках, обнаружились не только в крови подопытных животных, но и в их сперматозоидах. Таким образом, впервые наглядно продемонстрировано, что — как и предполагал Чарльз Дарвин в своей теории геммул и пангенезиса и вопреки теории о так называемом вейсмановском барьере — генетическая информация действительно может быть передана из соматических клеток в половые, по крайней мере в форме РНК.
В настоящее время признается существование двух уровней информации, на основе которых работают все живые клетки и многоклеточные организмы. Первый уровень — это генетическая информация (текст из четырех типов нуклеиновых оснований, кодирующий последовательности аминокислот в клеточных белках и хранящийся в хромосомах). С некоторой частотой в нуклеотидных последовательностях хромосом появляются изменения (мутации). Если эти мутации происходят в хромосомах половых клеток, то возникают вариации (аллели) генов, которые наследуются в соответствии с классическими законами Менделя.
Второй уровень — это эпигенетическая информация (обширный набор механизмов, определяющих условия, место и время считывания генетической информации). На основе эпигенетической информации осуществляется регуляция работы генов, и различия в этой регуляции серьезно влияют на фенотипические проявления одних и тех же генов у разных индивидуумов. Чтобы понять, насколько широки возможности эпигенетической информации, достаточно вспомнить, что все разнообразные клетки нашего организма, от клеток кожи до нейронов и эритроцитов, содержат одинаковые хромосомы с одинаковыми генами, а различаются исключительно эпигенетическими вариациями.
Изменения в эпигенетической информации (эпимутации) происходят гораздо чаще, чем в генетической. В основе эпимутаций лежат специфические химические модификации собственно ДНК (метилирование/деметилирование цитозинов) или связанных с ДНК белков — гистонов, а для осуществления этих химических модификаций в клетке работают специальные ферменты и регуляторы, включая как белки, так и особые регуляторные РНК. В сущности, именно на эпигенетической вариации и основана так называемая модификационная изменчивость, подразумевающая физиологически обусловленные приспособительные реакции организма на средовые воздействия.
Как постулировала догма синтетической теории эволюции, модификационная изменчивость не наследуется, ограничиваясь исключительно соматическими клетками, тканями и органами. Эта догма идет еще от Августа Вейсмана, который отвергал дарвиновскую теорию пангенезиса (согласно которой в клетках организма образуются особые мельчайшие частицы — геммулы, — несущие информацию о тех изменениях, которые клетки претерпели в течение жизни, и передающие ее с током крови в половые клетки; рис. 1, вверху) и настаивал на отсутствии каких-либо каналов коммуникации между соматическими и половыми клетками (так называемом «барьере Вейсмана»; рис. 1, внизу) и, как следствие, на принципиальной невозможности наследования приобретенных признаков.
Тем не менее уже с середины ХХ века было установлено, что некоторые эпимутации у растений склонны передаваться в длинной череде поколений. Это явление назвали эпигенетической трансгенерационной наследственностью. Часто эпигенетическая природа наследования может быть опознана по неменделевскому характеру расщепления анализируемого признака в потомстве: носителей нового признака оказывается в потомстве больше, чем должно было бы быть по классической схеме генетического наследования. Еще один признак того, что мы имеем дело с эпимутациями, а не с истинными мутациями — что индуцированная специфическими условиями фенотипическая вариация постепенно «затухает» в ряду поколений, если индуцирующие условия в дальнейшем не поддерживаются. Более того, в течение последнего десятилетия накапливаются данные о существовании эпигенетической трансгенерационной наследственности и у животных, в том числе у млекопитающих.
Пожалуй, наиболее впечатляющим из таких исследований можно признать статью Parental olfactory experience influences behavior and neural structure in subsequent generations, опубликованную в журнале Nature Neuroscience в начале 2014 года. В этом исследовании авторы вырабатывали у самцов мышей рефлекс избегания по отношению к запаху ацетофенона (природное ароматическое соединение, присутствующее, в том числе, в аромате черемухи), подавая в экспериментальную камеру одновременно с ацетофеноном разряды электрического тока, а затем получили потомство от скрещивания обученных самцов с необученными самками. Красота дизайна эксперимента заключалась в том, что рецепторный белок для ацетофенона и кодирующий его ген хорошо известны, так что результаты можно было регистрировать на всех уровнях — от экспрессии гена до анатомии обонятельного эпителия и изменений в поведении животных.
Тщательный анализ обнаружил, что у мышей в потомстве, во-первых, было повышено количество клеток с рецептором к данному соединению в обонятельном эпителии. Во-вторых, оказалась повышена восприимчивость животных к соответствующему запаху: зверьки демонстрировали более выраженную реакцию тревоги в ответ на сигнал опасности (громкий звук) в присутствии ацетофенона (но не пропанола, который распознается другими чувствительными клетками с другими рецепторами). Также выяснилось, что в сперматозоидах обученных мышей и их потомства был снижен уровень метилирования гена, который, собственно, и кодирует рецептор к ацетофенону. Эффект поддерживался в двух поколениях потомства, которые не проходили соответствующего обучения.
Авторы исключают вариант, что эпимутация, затронувшая именно ген рецептора к ацетофенону, в сперматозоидах опытных животных произошла случайно, поскольку идентичные сдвиги в фенотипе потомства на всех уровнях хорошо воспроизводились при многократных воспроизведениях опыта. Аналогичные результаты были получены и в том случае, если в родительском поколении обучали самок. При таком дизайне эксперимента новорожденных мышат сразу передавали необученной приемной матери, так что социальный фактор был исключен.
На сегодняшний день наиболее перспективными агентами переноса и индукции эпимутаций представляются регуляторные РНК, характеризующиеся способностью с высокой специфичностью переключать состояние хроматина и экспрессию генов на определенных участках хромосом. В 2010 году был опубликован обобщающий обзор с описанием целого ряда проведенных ими экспериментов по индукции трансгенерационной эпигенетической наследственности у мышей, где убедительно доказана ключевая роль РНК в реализации этой наследственности (M. Rassoulzadegan, F. Cuzin, 2010. The making of an organ: RNA mediated developmental controls in mice).
Имеются и претенденты на роль транспортных средств для переноса между клетками регуляторных РНК: это внеклеточные везикулы — мембранные пузырьки, производимые клетками всех тканей организма и способные передавать свое содержимое другим клеткам, в том числе других тканей. Надо отметить, что наработка этих везикул является процессом активным, тканеспецифичным и зависимым от физиологического состояния клеток. В частности, их производство резко возрастает, когда клетки испытывают стрессовые воздействия, причем в этих условиях меняется также и их содержимое, включающее разнообразные белки, матричные и регуляторные РНК. В мембране таких везикул могут присутствовать указатели «адреса доставки» в форме тканеспецифичных рецепторов, обеспечивая неслучайный характер такой формы межклеточной коммуникации.
Это всё рассуждения и гипотезы, но на практике до сих пор никто еще не брался проверить, могут ли на самом деле молекулы РНК быть доставлены от соматических клеток к половым, и если да, то принимают ли экзосомы в этом участие. Исследование, проведенное итальянскими учеными, и было нацелено на восполнение этого пробела. Схема поставленного авторами эксперимента предельно проста, она показана на рис. 2.
Рис. 2. Схема эксперимента по передаче информации от соматических клеток к сперматозоидам. Пояснения даны в тексте.
В геном клеток человеческой меланомной линии А-375 при помощи вирусного вектора был введен ген зеленого флуоресцентного белка (GFP), который исходно не присутствует ни в геноме человека, ни в геноме мыши, то есть легко отличим от эндогенных продуктов. Успешность операции проверили рядом тестов, которые продемонстрировали, что ген действительно встроился в ДНК, что с этого гена нарабатывается матричная РНК и что на этой матричной РНК нарабатывается белок (что и заставляет клетки светиться зеленым цветом, как видно на фотографии). Также были собраны и очищены экзосомы, вырабатываемые и высвобождаемые модифицированными клетками в культуральную среду. Провели те же тесты. Оказалось, что ДНК гена GFP в экзосомах нет, а вот РНК и собственно белок GFP — присутствуют. Наконец, модифицированные человеческие клетки меланомы ввели подкожно мышам (иммунодефицитным, чтобы не было отторжения человеческих клеток). Клеточная линия была выбрана исходя из того, что, по предварительным данным, эти клетки хорошо приживались у использованной линии мышей и интенсивно производили экзосомы, что повышало шанс на получение положительного результата. В исследовании было задействовано 25 животных, из которых пятнадцати (экспериментальная группа) были привиты модифицированные клетки (с геном GFP), а еще десяти (контрольная группа) — немодифицированные.
Через 45 дней (к этому времени трансплантированные клетки успевали размножиться и новообразованная опухоль имела объем около 1 см3) проводили итоговые исследования. Прежде всего, были проведены анализы на присутствие РНК гена GFP в крови животных (использовали смешанный препарат крови 10 зверьков экспериментальной группы). Для анализов использовали методы ПЦР и гибридизации нуклеиновых кислот. Результат оказался положительным. Затем убедились, что РНК гена GFP обнаруживается в экзосомах, очищенных из крови той же группы экспериментальных животных. И, наконец, эта же РНК была обнаружена в сперматозоидах. Препараты РНК сперматозоидов также готовили из смешанного образца от 10 животных и снова получили положительный результат. РНК гена GFP успешно детектировалась и в смешанном образце сперматозоидов, полученных от еще двух зверьков экспериментальной группы. Дополнительный анализ индивидуальных образцов РНК сперматозоидов от трех оставшихся зверьков дал один отрицательный результат и два положительных. Параллельно аналогичные процедуры и анализы выполнялись для образцов крови, экзосом и сперматозоидов от животных контрольной группы. Как и следовало ожидать, ни в одном из этих образцов РНК гена GFP не обнаруживалась, хотя реакции на присутствие РНК собственных генов были положительными как в экспериментальной, так и в контрольной группе.
Авторы работы делают заключение о том, что такого непреодолимого барьера, который бы делал невозможной передачу генетической информации между соматическими и половыми клетками, не существует, а значит, теоретически, передача РНК с экзосомами вполне может работать в качестве одного из механизмов, обеспечивающих трансгенерационное эпигенетическое наследование приобретенных родителями адаптивных модификаций. Конечно, дизайн эксперимента предполагал создание достаточно неестественной ситуации: ведь и ген был чужеродный, и сами донорские клетки — тоже, но тем более ожидаемым было бы срабатывание защитного барьера, если он действительно существует. И тем более вероятно, что аналогичные процессы могут иметь место в естественной физиологии.
Насколько точно обнаруженное явление соответствует Дарвиновскому пангенезису? Идея Дарвина заключалась в том, что геммулы, перенося какие-то вещества от соматических клеток к половым, могут менять материал наследственности в направлении, соответствующем выработанной на уровне соматических тканей адаптации, и, таким образом, благоприятствуют реализации адаптивно направленной эволюции. Но эпигенетическая наследственность, как было сказано выше, неустойчива и легко обратима, в то время как, говоря об эволюции, мы имеем ввиду некие устойчивые и трудно обратимые изменения, закрепленные в генотипе. Может ли перенос РНК в составе экзосом на самом деле обеспечить направленное изменение генома?
Можно предположить существование нескольких путей такого влияния. Во-первых, регуляторные РНК вызывают локальные изменения состояния хроматина, что должно сказываться определенным образом на распределении вероятностей мутационных событий на ДНК в тех или иных областях. Во-вторых, учитывая высокую активность обратной транскриптазы в сперматозоидах и их предшественниках, есть вероятность приобретения в ходе обратной транскрипции с матричных РНК новых ретрогенов либо редактирования уже имеющихся в геноме последовательностей по механизму конверсии (изменения нуклеотидной последовательности в геноме путем «списывания» с похожей, но не идентичной последовательности на внешней матрице, в том числе на матрице РНК или ее ДНК-копии). В-третьих, в свете данных рассматриваемой статьи, где был продемонстрирован перенос при участии экзосом РНК совершенно чужеродного гена между клетками разных видов (а именно, от человеческих меланомных клеток к мышиным половым), нельзя исключить и роль указанного механизма в горизонтальном переносе генов. Здесь можно вспомнить, например, нематод, в геном которых каким-то образом оказались встроены гены бактериального происхождения, благодаря чему этим организмам и удалось приспособиться к эффективному паразитизму на растениях.
Источник: ЭЛЕМЕНТЫ БОЛЬШОЙ НАУКИ
