Для поиска генов, связанных с меланомой, на модели мышей была использована система инсерционного мутагенеза малокопийным транспозоном. Частота мутаций в меланомах, индуцированных таким мутагенезом, была примерно в 100 раз меньше, чем в обычных опухолях. Это позволило отсечь мутации не связанные с онкогенезом. Удалось идентифицировать как известные, так и ранее неописанные гены и сигнальные пути с высокой вероятностью причастные к генезу меланомы.
При индукции и прогрессии раковых опухолей в клетках происходят мутации многих генов. Поэтому трудно установить, мутации каких из них и, следовательно какие гены имеют отношение к раку, а какие нет. С целью отсечь при анализе мутации не связанных с раком генов авторы применили инсерционный мутагенез малокопийным транспозоном piggyBac (PB). Эксперименты проводились на модели меланомы мышей BrafCA, у которых в меланоцитах кожи можно было включить мутантную форму гена BrafV600E, аналогичную человеческому BRAFV600E. Мутация BRAFV600E известна как инициатор меланомы, но ее недостаточно для развития опухоли. На основе мышей BrafCA были выведены две линии: в одну из них был введен PB, вставленный в ген люциферазы, в другую – ген PB-транспозазы, способный активироваться только в меланоцитах. При скрещивании мышей этих линий в меланоцитах потомства индуцировались транспозиции PB и происходил инсерционный мутагенез. У 8 из 17 таких мышей в течение 15 месяцев возникли меланомы. Аналогичным путем удалось вызвать меланомы у 3 мышей с геном Braf дикого типа.
Общее количество инсерций в этих 11 опухолях составляло в среднем 4,1 на опухоль. Это примерно в 100 раз меньше, чем количество мутаций, обычно наблюдаемое в меланомах. 60% инсерций было локализовано в транскрибируемых областях генов. Было идентифицировано 45 инсерций в 38 генах. Два из этих генов – Mitf и Cdkn2a несомненно связаны с раком. В меланомах человека MITF часто амплифицирован и активирован. И дейсвительно, инсерция PB в промоторную область Mitf в мышиной меланоме активировала его примерно в 7 раз. CDKN2A человека кодирует супрессор опухолей, и при раке он часто делетирован или инактивирован мутациями. Вставка PB в 3'- нетранслируемую область Cdkn2a подавляла экспрессию гена. Эти данные доказывают возможность применения использованной экспериментальной системы для поиска генов, связанных с онкогенезом.
Повторные случайные инсерции в тот же ген в разных опухолях практикески невероятны, так как частота инсерций ~ 4 на опухоль. Тем не менее повторные инсерции были обнаружены в пяти генах – Mitf, Arhgef3, Map3k1, Map3k2 и Rapgef2. Связь с раком Mitf уже была показана, а в отношении четырех других ее можно обоснованно предположить. Arhgef3 кодирует регулятор генов сигнальных ГТФаз семейства Rho. Предположение о роли Arhgef3 в онкогенезе косвенно подтверждается недавно полученными данными о том, что гены этого семейства часто активированы при меланоме человека.
Для ряда генов-кандидатов было проведено прямое исследование влияние инсерций на их функцию. Map3k1 и Map3k2 сильно активировались, и при этом независимо от состояния Braf активировался онкогенный сигнальный путь ERK. Ранее такая альтернативная активация не была известна. Инсерция в Rapgef2 и сопутствовавшая ей инсерция в Magi2 сильно подавляли Magi2 в опухолях. Эксперименты по подавлению Magi2 в культурах клеток подтвердили возможность участия этого события в онкогенезе. Аналогичные наблюдения и эксперименты с геном Ptpro дали такие же результаты.
Таким образом показано, что система мутагенеза с помощью малокопийного транспозона достоверно воспроизводит генетические основы онкогенеза. Она позволяет отсечь не имеющие отношения к раку мутационные события, что невозможно при рутинном секвенировании ДНК опухолей. С помощью этой системы удалось найти ряд генов и сигнальный путь, об участии которых в генезе меланомы не было известно.
Источник: MOLBIOL.RU
