За последние годы в арсенале ученых появилось сразу несколько технологий, позволяющих с легкостью направленно изменять последовательность генома живых организмов, причем не каких-нибудь микробов или мух (это умели делать уже давно), а млекопитающих. Вероятно, не за горами исправление вредных мутаций, приводящих к заболеваниям, и у человека. Однако пока новые технологии проходят проверку на эффективность на мышах. В начале этого года корейские ученые придумали, как использовать метод TALEN — один из способов направленного внесения разрыва в ДНК с последующим его «залечиванием» — для выключения генов у мышей. Сразу после них эту технологию применили для внесения в мышиный геном мутации, приводящей к развитию одного из наследственных синдромов. Авторам метода моделирования генетически обусловленных болезней удалось не только «испортить» мышиный геном, но и исправить его обратно.
B последнее время появилось целых три новых технологии целенаправленного изменения последовательности ДНК млекопитающих: CRISPR-редактирование, цинковопальцевые нуклеазы ZFN (Zinc finger nuclease) и TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease).
До наступления эры генетической инженерии исследователям, чтобы внести мутации в геном объекта, с которыми они работали, приходилось над этим объектом всячески измываться — поливать мутагенными химикатами, облучать ультрафиолетом и радиацией и т. д. При этом результат всегда становился сюрпризом. Потом, с изобретением полимеразной цепной реакции и изучением гомологичной рекомбинации, манипуляции с геномом значительно упростились. Мы можем ввести в клетку ДНК, комплементарную участку генома, но содержащую нужную нам мутацию, и какой-нибудь ген-маркер, который позволит отобрать мутантов, — например, ген устойчивости к антибиотику. Дальше в дело вступает гомологичная рекомбинация. Если в клетке содержится два набора хромосом, эти хромосомы называются гомологичными. В определенных случаях они могут обмениваться участками, этот процесс и называется гомологичной рекомбинацией. Если в клетке есть какая-нибудь еще ДНК, введенная искусственно, обмен может произойти и с ней, главное, чтобы участники обмена содержали похожие последовательности. Однако в норме это очень редкое событие, поэтому и приходится «метить» клетки, в которых обмен произошел; их можно отыскать на среде с антибиотиком или при помощи специальных приборов, если маркером служит флуоресцентный белок.
Чтобы повысить эффективность этого процесса, можно внести в то место в ДНК, которое мы хотим изменить, двухцепочечный разрыв. Разрыв в ДНК для клетки — очень тревожное событие, и она старается его «зашить» с помощью систем репарации. Здесь есть два возможных пути: гомологичная рекомбинация с другой хромосомой (или любой ДНК) либо негомологичное спаривание концов. В первом случае после «ремонта» всё становится как было, а в результате второго процесса часто остаются следы — как правило, небольшие делеции (мутации, характеризующиеся отсутствием какого-либо фрагмента ДНК). Если исходно исследователи намеревались сломать ген, цель можно считать достигнутой: с большой вероятностью, продукт этого гена будет испорчен. Если же в клетку ввести в качестве матрицы для рекомбинации нужную последовательность ДНК, поврежденный участок заменится на нужный исследователям фрагмент (опять же, с некоторой вероятностью). Именно на этом принципе основаны способы направленной модификации генома ZFN и TALEN, упомянутые выше.
Рис. 1. Схема работы и области применения TAL-белков. ДНК-связывающий участок TAL-белка изображен серым, в виде комплекса из нескольких нуклеотид-узнающих единиц. Комбинируя такие единицы, можно заставить TAL связаться с любой последовательностью в геноме. Пришив к нему активаторный (AD) или репрессорный (RD) участок, можно направленно регулировать активность генов (соответственно, активировать или подавлять). Если соединить TAL-домен с нуклеазой FokI, получится TALEN — инструмент для направленного разрезания геномной ДНК. Так же, как и в случае с цинковопальцевыми нуклеазами, FokI работает в форме димера.
Как внести двухцепочечный разрыв именно туда, куда нужно? Собственно задачу разрезания ДНК отлично выполняет нуклеаза FokI — белок, способный разрезать любую последовательность ДНК на некотором расстоянии от места узнавания (последовательности из 5 нуклеотидов). Однако участки узнавания для FokI встречаются по всему геному, а разрыв нужно внести в какое-то конкретное место, например в интересующий исследователей ген. Для решения этой проблемы ученые обратили внимание на различные ДНК-связывающие белки, например транскрипционные факторы. Эти белки изменяют активность генов, связываясь с определенными последовательностями в их регуляторных областях.
Поначалу особую привлекательность представляли так называемые домены «цинковых пальцев» — ДНК-связывающие участки белков, в поддержании структуры которых участвует ион цинка. Каждый такой «палец», как правило, узнает три определенных нуклеотида. Учитывая, что белки с «цинковыми пальцами» весьма разнообразны, удалось создать «код цинковых пальцев». Комбинируя разные «пальцы», можно создать белок, который в клетке будет направленно привлекаться к определенной последовательности ДНК. Если пришить такой домен к нуклеазе, полученный белок будет разрезать ДНК только в нужном месте (рис. 2).
Рис. 2. Схема, изображающая работу цинковопальцевой нуклеазы. Участки «цинковых пальцев» (серые) подобраны так, чтобы узнавать последовательности с обеих сторон от места, куда требуется внести разрыв. Это необходимо, чтобы нуклеаза FokI могла разрезать ДНК (она работает в форме димера).
Однако «код цинковых пальцев» оказался недостаточно полным, чтобы можно было привлечь белок к любой последовательности. К тому же, остается небольшая вероятность, что «палец» распознает не свои три нуклеотида, и тогда ДНК будет порезана не только там, где нужно, но и где-то еще, что может оказаться губительным для клетки.
Более изящное решение нашлось у бактерий из рода Xanthomonas. Это патогенные бактерии, поражающие растения. У них есть группа TAL-белков, которые выполняют функции транскрипционных факторов, то есть в конечном итоге регулируют количество того или иного белка — не только в клетке бактерий, но и у высших организмов (в данном случае, у растений). Когда бактерии заражают растение, TAL-белки проникают в ядро растительной клетки, и начинают там хозяйничать, изменяя экспрессию генов так, чтобы принести пользу бактериям. ДНК-узнающий участок TAL-белков состоит из нескольких повторяющихся единиц, каждая из 34 аминокислот (кроме последней, которая состоит из 20 аминокислот). В большинстве случаев таких повторов 13 либо 28. Все повторяющиеся единицы одинаковы, кроме аминокислот, стоящих в позициях 12 и 13 (этот участочек называется RVD — repeat-variable di-residue).
Разные RVD связываются с разными нуклеотидами (каждая пара аминокислот — с одним). Для каждого из четырех нуклеотидов, из которых состоит ДНК, есть наиболее часто встречающаяся пара аминокислот. Таким образом, комбинируя структурные единицы с разными RVD, можно без труда создать ДНК-связывающий участок белка, узнающий нужную последовательность (единственное ограничение — в начале последовательности должен стоять нуклеотид T). Учитывая количество повторов, можно быть уверенным, что белок будет связываться именно там, где нужно, в сколь угодно большом геноме. Таким образом можно направленно регулировать активность генов, а если пришить к TAL-повтору нуклеазу FokI (рис. 1), получится практически идеальный инструмент для редактирования генома — TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease).
Из технологий цинковопальцевых нуклеаз и TALEN ученые уже вовсю извлекают практическую пользу. Пока что с их помощью успешно удавалось создавать так называемых нокаутных животных, то есть животных, у которых какой-либо ген не функционирует (за технологию создания нокаутных мышей в 2007 году была вручена Нобелевская премия по физиологии и медицине.
До сих пор ZFN и TALEN применялись в основном для работы на клеточных культурах или рыбках Danio rerio, но в начале года корейские ученые опубликовали в Nature Biotechnology статью, в которой описали создание нокаутной мыши при помощи TALEN. При традиционном подходе для создания нокаутных животных требуется забрать несколько клеток из эмбриона на самых ранних стадиях развития, модифицировать их и вернуть обратно. Из такого эмбриона вырастает так называемое мозаичное животное, часть клеток в котором модифицирована, но большая часть не изменена. Далее следует ряд скрещиваний — в надежде, что у какой-то из мозаичных мышей модифицированными окажутся половые клетки и среди потомства будет мышь, гетерозиготная по нужному признаку (то есть с одним нормальным, а вторым мутантным аллелем исследуемого гена). В новом подходе матричную РНК, кодирующую нужную нуклеазу TALEN, вводят прямо в одноклеточную зиготу, образовавшуюся после оплодотворения яйцеклетки, на стадии пронуклеуса (когда в клетке присутвуют одновременно два ядра — от яйцеклетки и от сперматозоида). Выросшая мышь сразу же является гетерозиготой по нужному признаку (значительное упрощение процесса!). Дальше, если нужно, в одну стадию можно получить потомков-гомозигот, то есть мутантных по обоим аллелям данного гена.
Авторы статьи в Nature Biotechnology создали мышей, дефектных по гену Pibf1 (progesterone immunomodulatory binding factor) и по гену Sepw1 (selenoprotein W, muscle 1). В обоих случаях они вносили при помощи TALEN разрыв в кодирующую область гена, разрыв залечивался негомологичным соединением концов ДНК. В результате ученые детектировали небольшие делеции в гене, которые приводили к синтезу нефункционального белка.
Их коллеги из Мюнхена пошли дальше и решили не просто испортить ген, а внести в него нужную мутацию. Для этого вместе с мРНК TALEN они ввели в одноклеточный эмбрион короткую одноцепочечную ДНК (144 нуклеотида), которая была комплементарна участку хромосомы, подлежащему изменению, и содержала мутацию. Эта цепочка ДНК должна была послужить матрицей для гомологичной рекомбинации при залечивании разрыва, который вносила TALEN. Целью для внесения мутации стал ген Rab38, кодирующий белок, который участвует в регуляции внутриклеточного транспорта (в том числе, транспорт пигментов). Мутации в этом гене у человека приводят к развитию наследственного синдрома Германски–Пудлак (Hermansky–Pudlak_syndrome), который характеризуется пониженной пигментацией (альбинизмом), нарушениями свертывания крови и отложением в тканях воскоподобной субстанции (при этом страдают внутренние органы, в первую очередь легкие и почки). Для того чтобы смоделировать подобные симптомы у мышей, оказалось достаточно заменить в белке RAB38 одну-единственную аминокислоту (замена глицина на валин в 19-й позиции). Полученный фенотип был назван chocolate из-за нарушения пигментации (если в норме мышки черные, мутантные мышки «светлеют» и становятся коричневыми, см. рис. 3).
Рис. 3. Мутация chocolate в гене Rab38 превращает мышь из черной в коричневую (b) в результате нарушения пигментации. Фотографии с и d демонстрируют нарушенную пигментацию глаз у двухдневного мышонка.
Итак, исследователи сконструировали соответствующую нуклеазу TALEN (TALENRab38), а для контроля — цинковопальцевую нуклеазу (ZFNRab38), которая должна была вносить разрыв в то же место. Когда активности обеих конструкций были проверены на репортерном гене в клеточной культуре, оказалось, что TALEN работает в два раза лучше, чем ZFN. Затем TALEN ввели в одноклеточный мышиный эмбрион вместе с одноцепочечной матрицей для рекомбинации (естественно, что эмбрионов было несколько; см. рис. 4а). В результате из 117 мышей, полученных таким способом, 7 несли мутации в гене Rab38, хотя всего одна мышь была носителем нужной аминокислотной замены (остальные несли делеции, образованные в результате негомологичного спаривания концов). После скрещивания между собой потомства этой мыши удалось получить гомозиготного носителя мутации chocolate, демонстрирующего нужный фенотип (рис. 3, 4a).
Рис. 4. Схема эксперимента по внесению мутации chocolate в геном мыши дикого типа (a) и исправление мутантного фенотипа (b). TALEN вводят в одноклеточный эмбрион вместе с одноцепочечной ДНК, которая служит матрицей для рекомбинации. Нуклеаза вводит разрыв в одно из ядер (материнское или отцовское), разрыв репарируется путем рекомбинации с одноцепочечной ДНК. Полученная мышь является основателем мутантной линии Rab38cht, либо основателем «исправленной» линии (Rab38WT).
В следующем эксперименте исследователи решили вернуть фенотип «шоколадной» мыши к нормальному аналогичным способом. На этот раз в одноклеточный эмбрион «шоколадной» мыши ввели TALEN и одноцепочечную ДНК, исправляющую мутацию (рис. 4b). Нужная мышь была получена (хотя эффективность гомологичной рекомбинации тоже была значительно ниже, чем эффективность негомологичного соединения). Авторы работы предполагают, что можно увеличить выход продуктов гомологичной рекомбинации, если искусственно затормозить процесс негомологичного спаривания концов (действительно, такой эффект был показан на дрозофиле).
Как бы нам ни было жалко мышей, адекватные модели для изучения человеческих болезней необходимы. С появлением секвенирования геномов очень быстро накапливаются данные о мутациях, которые приводят к тем или иным наследственным заболеваниям. Для изучения этих заболеваний и разработки эффективной терапии приходится моделировать ситуацию на мышах. Как показали авторы упомянутых выше работ, теперь для этого есть технология, с помощью которой можно «с минимальными усилиями и в кратчайшее время» вносить изменения в геном (и, что немаловажно, использовать при этом гораздо меньше лабораторных животных). Кроме того, эта технология весьма перспективна для лечения человека. Конечно, манипуляции с человеческими эмбрионами никто пока проводить не собирается, однако геном отдельных клеток уже взрослого организма вполне успешно модифицировали (правда, при помощи традиционных технологий) для борьбы с раком.
Источник: ЭЛЕМЕНТЫ
