Предполагаемый механизм работы белка PRDM9. У нормальных мышей (Wild type, слева) PRDM9 в начале мейоза присоединяется к участку ДНК с определенной последовательностью нуклеотидов (PRDM9 binding site), которую он распознает при помощи своих «цинковых пальцев» (разноцветные выступы). Здесь белок ставит «эпигенетическую метку» (H3K4me3 — триметилирование лизина 4 гистона H3) и привлекает аппарат разрезания ДНК (ножницы). Образующийся разрыв двойной цепи ДНК (DSB, double-strand break) в дальнейшем используется для рекомбинации (кроссинговера) или залечивается. У мышей-мутантов, не имеющих белка PRDM9 (Prdm9–/–, справа), «ножницы» направляются к другим эпигенетическим меткам, поставленным другими белками. Многие из этих меток расположены в промоторах активных генов (желтые прямоугольнички). Разрывы ДНК в этих участках нарушают нормальный ход мейоза, что ведет к бесплодию. Изображение из обсуждаемой статьи в Nature.
Ген Prdm9 — единственный идентифицированный у млекопитающих ген гибридной стерильности («ген видообразования»). Неудачное сочетание аллелей (вариантов) Prdm9 с другими генами приводит к бесплодию межвидовых гибридов у мышей. У людей мутации в этом гене тоже могут приводить к мужскому бесплодию. Ген Prdm9 необходим для рекомбинации (обмена фрагментами хромосом) при формировании половых клеток. Он определяет места, в которых ДНК рвется на начальном этапе рекомбинации. Новое исследование американских ученых подтвердило, что Prdm9 определяет локализацию почти всех «горячих точек рекомбинации» при формировании сперматозоидов. У мышей с отключенным Prdm9 разрывы ДНК в начале мейоза возникают в основном в функциональных участках генома — промоторах. Такие мыши бесплодны. У животных с работающим Prdm9 ДНК рвется в других, преимущественно нефункциональных, участках ДНК. Хотя исследователи сильно приблизились к пониманию механизма работы «гена видообразования», нерешенных вопросов осталось еще много.
Развитие генетической несовместимости (постзиготической изоляции) между двумя популяциями часто начинается со снижения плодовитости гибридов вплоть до их полной стерильности. Гибридная стерильность возникает в результате закрепления в популяции каких-либо аллелей, конфликтующих (несовместимых) с аллелями, закрепившимися в другой популяции (подробнее см. в заметке Генетическая несовместимость нарастает по параболе, «Элементы», 26.09.2010).
Для понимания процесса видообразования важно выяснить, изменения каких генов чаще всего порождают такие конфликты. В принципе, при отдаленных скрещиваниях конфликтовать может что угодно с чем угодно, но интересно было бы найти конкретные гены, изменения которых приводят к гибридной стерильности у конкретных организмов. Для таких генов придумано броское название — «гены видообразования» (speciation genes), но идентифицировать их удается лишь в немногих случаях. Несколько генов видообразования найдено у мушек-дрозофил (Orr et al., 2004. Speciation genes, PDF, 107 Кб) иурастений (Rieseberg & Blackman, 2010. Speciation genes in plants, PDF, 336 Кб).
Что касается млекопитающих, то у них пока описан только один такой ген — Prdm9, ответственный за стерильность мужского потомства при скрещивании домовых мышей Mus musculus musculus и Mus musculus domesticus. То, что где-то на 17‑й мышиной хромосоме есть «ген гибридной стерильности», конфликтующий с несколькими другими генами при межвидовых скрещиваниях, было известно давно, но установить его идентичность удалось лишь в 2008 году (Mihola et al., 2008. A Mouse Speciation Gene Encodes a Meiotic Histone H3 Methyltransferase, PDF, 530 Кб). С тех пор ген Prdm9 активно изучают. При этом выяснилось много интригующих фактов. В частности, обнаружилась связь Prdm9 со стерильностью не только у гибридных мышей, но и у других животных. Например, у людей некоторые мутации этого гена приводят к мужскому бесплодию (Irie et al., 2009. Single-Nucleotide Polymorphisms of the PRDM9 (MEISETZ) Gene in Patients With Nonobstructive Azoospermia).
Белковый продукт гена Prdm9 (белок PRDM9) является ферментом гистон-H3-лизин-4-триметилтрансферазой. У этого белка есть участок («цинковый палец»), связывающийся с определенными нуклеотидными последовательностями ДНК. Функция фермента состоит в нанесении особой эпигенетической метки на один из гистонов (белков, на которые наматывается ДНК в клетке). Данная метка (триметилирование 4‑го лизина гистона H3) часто, хотя и не всегда, наносится там, где расположены промоторы генов, активных в данной клетке. Метка повышает активность гена. При этом PRDM9 — не единственный белок, умеющий наносить эту метку; есть и другие белки с такой же функцией.
Правильная работа PRDM9 необходима для формирования половых клеток. Мыши с отключенным геном Prdm9 жизнеспособны, но бесплодны: у них нарушается спаривание хромосом во время мейоза и не образуются нормальные половые клетки. По-видимому, PRDM9 при помощи эпигенетических меток активирует гены, необходимые для мейоза. Может быть, этим и объясняется его связь с гибридной стерильностью?
Впрочем, вскоре выяснилось, что всё гораздо сложнее. PRDM9 не только регулирует активность генов при мейозе, но и каким-то образом влияет на то, в каких местах хромосомы будут рваться, чтобы обменяться участками (рекомбинировать) в процессе кроссинговера.
Рекомбинация начинается с появления разрывов в двойной спирали ДНК. Эти разрывы, как правило, появляются не где попало, а в строго определенных местах — горячих точках рекомбинации (см. recombination hotspot). Так вот, оказалось, что у животных с разными аллелями Prdm9 наборы горячих точек различаются. Это справедливо и для мышей, и для людей (Baudat et al., 2010. PRDM9 Is a Major Determinant of Meiotic Recombination Hotspots in Humans and Mice, PDF, 811 Кб).
Кроме того, выяснилось, что «цинковые пальцы» этого белка, которыми он распознает последовательности нуклеотидов ДНК, а также, предположительно, сами эти распознаваемые последовательности, подвергались ускоренной эволюции под действием отбора в разных группах животных (Oliver et al., 2009. Accelerated Evolution of the Prdm9 Speciation Gene across Diverse Metazoan Taxa). Это наводит на мысль, что связь PRDM9 с гибридной стерильностью определяется не столько тем, что он регулирует активность генов при мейозе, сколько тем, что он контролирует положение горячих точек рекомбинации.
В недавнем выпуске журнала Nature американские биологи сообщили, что им удалось сделать следующий важный шаг к расшифровке принципов работы «гена видообразования». При помощи новой усовершенствованной методики авторы выявили практически все горячие точки рекомбинации у двух линий мышей, у которых почти все гены одинаковы, а различаются только аллели Prdm9. Методика основана на том, что к свободным концам ДНК, образующимся в результате разрывов на ранней стадии мейоза, прикрепляется особый белок (DMC1). При помощи антител к белку DMC1 концы можно «поймать» и затем отсеквенировать. Это позволяет определить, в каком месте порвалась хромосома. В каждом отдельном зреющем сперматозоиде разрывов образуется немного (200–400, из них только 20–25 будут использованы для кроссинговера, а остальные просто соединятся обратно), но если выделить ДНК из множества клеток (например, из целого семенника), то можно обнаружить все горячие точки, характерные для данного генотипа.
У одной из мышиных линий (9R) авторы нашли 14 869 горячих точек, у другой (13R) — 15 481. Самое интересное, что их наборы почти не пересекаются: только 163 горячие точки оказались общими для обоих генотипов. Для сравнения исследовали обычную лабораторную линию мышей (C57BL/6), у которой аллель Prdm9 такой же, как у 9R. Наборы горячих точек у них оказались почти одинаковыми: 98% горячих точек, характерных для 9R, обнаружилось и у C57BL/6. Следовательно, PRDM9 определяет положение подавляющего большинства горячих точек рекомбинации. Это — первый важный вывод исследования.
Второй вывод состоит в том, что горячие точки образуются как раз там, где в ДНК имеются последовательности нуклеотидов, распознаваемые «цинковыми пальцами» данного аллельного варианта Prdm9. Каждый вариант имеет свою предпочитаемую «идеальную» последовательность, но может прикрепляться и к последовательностям, слегка отличающимся от идеала. Чем ближе последовательность к идеалу, тем «горячее» точка рекомбинации (иными словами, тем чаще именно в этом месте рвется ДНК в начале мейоза).
Исследование также подтвердило, что горячие точки возникают там, где имеются вышеупомянутые эпигенетические метки (триметилированные четвертые лизины гистона H3). Впрочем, таких меток намного больше, чем горячих точек. Метки можно условно подразделить на две группы. Метки первой группы находятся в одних и тех же местах (в основном в промоторах генов) независимо от аллельного состояния Prdm9. Большинство этих меток, судя по всему, наносятся не PRDM9, а другими гистон-метилтрансферазами. Метки второй группы приурочены в основном к нефункциональным участкам ДНК. Они располагаются в разных местах генома у мышей с разными версиями PRDM9, и именно там, где есть последовательности нуклеотидов, распознаваемые «цинковыми пальцами» данной версии PRDM9. Именно по этим меткам, специфичным для каждого аллеля Prdm9, и рвутся хромосомы в начале мейоза.
Решающим этапом работы стало изучение мышей с отключенным геном Prdm9 (генотип Prdm9–/–). Такие мыши, как уже говорилось, бесплодны. Мейоз у них с самого начала идет вкривь и вкось, парные хромосомы не могут правильно объединиться, и жизнеспособные половые клетки не формируются. Однако на ранних этапах мейоза у них всё же формируются разрывы в ДНК, как у нормальных животных. Ключевой вопрос состоит в том, где формируются эти разрывы в отсутствие главного «дирижера» рекомбинации — белка PRDM9?
Можно было бы ожидать, что разрывы ДНК у мышей Prdm9–/– будут образовываться где попало, хаотически, и никаких «горячих точек рекомбинации» выявить не удастся. Но всё оказалось еще интереснее. Горячие точки у мутантных мышей есть, хотя их расположение совсем другое. Они почти всегда (в 94% случаев) приурочены к эпигенетическим меткам — триметилированным гистонам H3, как и у обычных мышей. Но, поскольку у мышей-мутантов нет PRDM9, у них имеются эпигенетические метки только первой из двух категорий: те, что не зависят от PRDM9, одинаковы у всех линий и часто располагаются в промоторах. Именно здесь и рвутся хромосомы у мышей-мутантов Prdm9–/–. Кончается это плохо — то ли потому, что разрывы в промоторах нарушают работу генов, которые должны оставаться активными во время мейоза, то ли потому, что активность гена мешает залечить разрыв в его промоторе, то ли по каким-то иным причинам.
Таким образом, исследование выявило новую функцию PRDM9. Оказалось, что этот белок перенаправляет механизм разрезания ДНК (см. SPO11) от функционально важных участков генома к менее важным. В норме горячие точки рекомбинации возникают там, где PRDM9 прикрепляется к ДНК и ставит эпигенетическую метку на гистоне H3. Если же белок PRDM9 отсутствует, горячие точки формируются там, где есть такие же метки, поставленные другими белками (см. рисунок).
Можно надеяться, что новые данные о работе PRDM9 позволят вскоре окончательно расшифровать механизм гибридной стерильности у мышей, а заодно, может быть, помогут в лечении мужского бесплодия у людей.
Правда, нерешенных вопросов остается еще много. Упомянем два из них:
1) Хотя белок PRDM9 обнаружен у большинства животных, у некоторых групп он отсутствует (птицы, рептилии, амфибии, двукрылые насекомые, а из млекопитающих — собаки, волки и койоты). Вероятно, у них работают какие-то иные механизмы формирования горячих точек рекомбинации (Muñoz-Fuentes et al., 2011. Prdm9, a Major Determinant of Meiotic Recombination Hotspots, Is Not Functional in Dogs and Their Wild Relatives, Wolves and Coyotes).
2) Авторы обсуждаемой работы обнаружили, что в геноме мыши есть маленький участок, в котором образование горячих точек не зависит от PRDM9. Он расположен в псевдоаутосомной области половых хромосом (см. Pseudoautosomal region). Здесь находится сгущение горячих точек, приуроченных к эпигенетическим меткам, но PRDM9 не влияет на их расположение. Уникальность псевдоаутосомной области состоит в том, что в ней рекомбинация обязательно происходит при каждом мейозе (предполагают, что это важно для правильного спаривания половых хромосом). Всё это показывает, что в механизмах рекомбинации и репродуктивной изоляции остается еще много загадок.
Источник: ЭЛЕМЕНТЫ
