На протяжении многих десятилетий главной «молекулой жизни» считалась ДНК. И это в общем-то правильное мнение несколько заслоняло ту важную роль, которую в живом организме играет другая похожая молекула — РНК. Считалось, что для лечения генетических болезней необходимо вносить изменения в сами гены, то есть в структуру ДНК.
Ситуация начала меняться с некоторых важных открытий конца XX — начала XXI веков, отмеченных Нобелевской премией 2007 года. Идея оказалась довольно простой: если ДНК содержит «вредную» информацию, которую трудно или невозможно исправить, то эту информацию можно просто не замечать. Для этого надо только соответствующим образом «настроить» ту молекулу, которая её считывает — а это и есть РНК.
Попытки осуществить такую «облегчённую» программу предпринимают сейчас разнообразные фармакологичекие фирмы. И хотя трудностей, с которыми они уже столкнулись, пока значительно более многочисленны, чем успехи, которыми они могут похвастаться, результаты их исследований внушают оптимизм.
Молчание — золото
Правильно сконструированный интерферирующий фрагмент РНК может буквально «выключить» ненужный ген и остановить тем самым развитие болезни на самой ранней стадии. Интерферирующие РНК назвали siRNA (Small interfering RNA), и в 2006 году за открытие этого феномена была вручена Нобелевская премия по физиологии и медицине.
Первое лекарство на основе РНК было одобрено к клиническому применению ещё в 1998 году. Это фомивирзен (торговое название «Витравен»). Сегодня препарат активно используют для борьбы с цитомегаловирусной инфекцией у больных со сниженным иммунитетом, в том числе больных СПИДом. «Витравен» связывается с одним из ключевых генов цитомегаловируса, останавливая его экспрессию, и подавляет размножение вируса.
За первой победой последовали клинические испытания других лекарственных препаратов. Так, в 2006 году, спустя 8 лет после открытия феномена РНК-интерференции, американская фармацевтическая компания Sirna Therapeutics начала испытания нового лекарства, цель которого — излечение возрастной слепоты, так называемой возрастной макулярной дегенерации сетчатки. Болезнь вызвана неконтролируемым ростом кровеносных сосудов в центральной части сетчатки и приводит к потере зрения. Ежегодно в мире этот диагноз ставят более чем полумиллиону человек, и это только зарегистрированные случаи.
Однако препарат, который тестировала компания, не был одобрен. Неудачной оказалась и попытка, предпринятая американской компанией OpkoHealth. Созданный ими препарат прошёл фазу II клинических испытаний, но для него был показан неспецифический эффект: лекарство действовало не только на белковый синтез, но и вызывало иммунный ответ. На сегодняшний день для лечения возрастной слепоты одобрено лишь одно лекарство на основе интерферирующей РНК — «Макуген». Его вводят инъекционно в глазное яблоко, так что лекарство действует локально, там, где его действие необходимо.
Глазное яблоко — не единственный «удобный» орган для точечного фармацевтического воздействия. Компания Alnylam Pharmaceuticals начала фазу III клинических испытаний лекарства с интерферирующей РНК, которое предполагается использовать в виде аэрозоли или ингалятора. Мишень — эпителиальные клетки в лёгких. Воздействие нового препарата предназначено для лечения синцитиальной вирусной инфекции, которая особенно распространена у грудничков и маленьких детей.
Ещё один пример недуга, с которым пытаются бороться с помощью РНК-интерференции, — болезнь Хантингтона. Ею занимается Филлип Саморе (Phillip Zamore), профессор медицинского факультета Массачусетского университета (University of Massachusetts Medical School). Болезнь Хантингтона — генетически обусловленная дегенерация нервной системы. Первые симптомы появляются в 35–50 лет, когда в нервных клетках нарушается структура белка хантингтина. Физиологическая функция этого белка неизвестна, но у больных людей форма строения его молекулы нарушена, и он становится токсичным для нервных клеток. В экспериментах Саморе показал, что инъекции мышам siRNA, которая останавливает экспрессию неправильного белка, снимают симптомы болезни.
Одна из сложностей с разработкой препаратов с РНК-интерференцией состоит в том, что хотя интерферирующая РНК блокирует считывание конкретного гена, происходит это по всему телу, в клетках всех органов. Каждая клетка тела человека несёт генетическую информацию, которой достаточно, чтобы развить новый организм с нуля. Но формирование конкретных органов и тканей зависит от того, какие гены работают в том или ином месте и с какой силой происходит считывание генетической информации. Чтобы получить хороший терапевтический эффект, необходимо, чтобы siRNA действовала на конкретный ген в конкретном органе. Пока же она воздействует на считывание гена по всему телу, поэтому затрагивает многие органы и ткани, оказывая побочное действие.
Кроме этого, многие заболевания требуют системного вмешательства. Если мы говорим о разработке лекарства для глаз или лёгких, то здесь всё просто: лекарство можно закапать в глаз или ингалировать в легочные пути. Чтобы победить, к примеру, метастазы рака или гипертонию (которые сами по себе не локализованы), требуется системное введение лекарства — инъекция в кровь, чтобы лекарство дошло во все органы и ткани. Но если мы что-то вводим в кровоток, то кровь разносит это по всему телу, не удерживает внутри сосудов, лекарство проникает в капилляры и через их проницаемые стенки может оказаться в органах и тканях тела. Здесь воздействие на считывание гена нежелательно, вот и получается побочный эффект.
Не так давно компания Alnylam Pharmaceuticals объявила о получении разрешения на испытания на людях интерферирующей РНК для лечения гипертонии и опухолевых процессов в печени. Предварительные испытания на мышах и обезъянах позволяют надеяться, что и системное введение siRNA может быть эффективным без нежелательных побочных последствий.
При использовании РНК-интерференции очень важно установить, имеет ли болезнь полиморфные участки гена. Дело в том, что один и тот же ген у разных людей может «звучать» по-разному, последовательность строительных кирпичиков ДНК — нуклеотидов — может различаться (хотя в конечном итоге ген выполняет у всех одну и ту же функцию). Такой полиморфизм, индивидуальные небольшие вариации в составе ДНК какого-либо гена, — настоящая «головная боль» для медиков, ведь siRNA создана, чтобы узнавать и воздействовать на строго определенную последовательность нуклеотидов, а когда появляется полиморфмизм, siRNA может не узнать свою мишень, и лекарство будет неэффективным. В таком случае остаётся только делать индивидуальный генетический анализ для каждого пациента и на его основе синтезировать уникальное лекарство. Но это очень дорого.
Не siRNA единой…
Помимо siRNA учёных привлекает и другой класс — микроРНК, малые ингибирующие РНК (miRNA). На сегодняшний день известно более восьми тысяч микроРНК, которые сами по себе не несут информацию о гене, но регулируют его экспрессию (считывание генетической информации) и выработку биологически активных веществ. Главная трудность — установить точную функцию конкретной микроРНК.
МикроРНК может связаться с участком, где начинается экспрессия гена, и тогда экспрессия станет невозможной. В результате белок, который кодируется этим геном, перестанет синтезироваться. Например, если микроРНК блокирует считывание гена, ответственного за выработку организмом гормона инсулина, то теоретически можно синтезировать и ввести в организм короткую молекулу РНК, которая содержит комплиментарные нуклеотиды. Такие комплиментарные нуклеотиды связываются с нуклеотидами микроРНК. МикроРНК не может сесть на ген, и соответственно, она не блокирует эксперссию гена, выработка инсулина возрождается и теоретически человек излечивается от диабета.
Первые результаты многообещающие. Так, стало известно, что miR214 отвечает за выработку инсулина поджелудочной железой. Согласно работам профессора Гая Руттера (Guy Rutter) с медицинского факультета Имперского Колледжа Лондона (Imperial college London), ему удалось с помощью небольших синтетических молекул инактивировать микроРНК, чтобы повысить продукцию инсулина в организме.
РНК-терапия таит в себе немало трудностей, одна из которых доставка препарата к месту назначения. Молекулы РНК достаточно велики, поэтому способны вызывать иммунный ответ. Такие реакции сопровождаются жаром, воспалительными процессами, общим недомоганием.
В декабре 2008 года фармацевтическая компания Regulus Therapeutics объявила об успешных испытаниях на животных синтетических молекул, блокирующих miR-21, которая в больших количествах присутствует в сердце. Блокирование miR-21 предотвращает инфаркты у лабораторных мышей. Предметом пристального изучения этой компании стал и miR-122, необходимая для размножения вируса гепатита С.
Наконец, самый новый и вызывающий много споров подход — это применение коротких двухцепочечных антигенРНК. В отличие от традиционных siRNA, антигенРНК действуют не на информационную РНК, а прямо на ДНК, на промоторы генов (это участки ДНК, которые регулируют активность смежных генов). Детализированный механизм такого действия пока изучается, однако предполагается, что антигенРНК связывается с участком гена, который регулирует траскрипцию, то есть перенос генетической информации с ДНК на РНК. После этого антигенРНК привлекает особые белки. В итоге на участке гена формируется большой комплекс из РНК и белков, препятствующий нормальному функционированию гена. Учитывая, что многие промоторы в нормальных условиях ингибированы, удерживают экспрессию гена в подавленном состоянии, то использование антигенРНК может заглушить воздействие промотора и раскрепостить экспрессию желаемого гена. На сегодняшний день такой гипотетический путь остаётся чуть ли не единственным для усиления экспрессии гена, в то время как другие виды РНК позволяют только уменьшать активность генов.
Классическая интерференция — это действие siRNA, остальные короткие РНК (микроРНК и антигенРНК) по механизму действия в какой-то степени напоминают интерференцию, но не укладываются в привычную схему. Поэтому одни учёные считают это тоже интерференцией, другие же — выделяют в отдельные группы.
Подводные камни и рифы РНК-терапии
Несмотря на многообещающие предварительные результаты, РНК-терапия всё ещё остается в стадии экспериментов. Основная пробема — сделать РНК стабильной, уберечь от деградации в живых клетках. Современные препараты на основе РНК остаются в организме от 14 до 30 дней, этого достаточно, чтобы получить терапевтический эффект, но для лечения хронических заболеваний требуется больше времени. Теоретически некоторые химические модификации РНК могут сделать её менее уязвимой для внутренних разрушающих РНК ферментов.
Однако на этом проблемы не заканчиваются. Даже очень короткие РНК не способны пересечь гемато-энцефалический барьер — заслон, защищающий нейроны от проникновения из крови различных веществ, которые могут оказаться токсичными для мозга. К сожалению, в разряд таких молекул попадают и фрагменты РНК. Чтобы доставить РНК в мозг, приходится использовать изощрённые приёмы: например, можно использовать непатогенный вектор — молекулу-доставщик, которая, будучи абсолютно безобидной, способна пробраться в потаённые уголки организма и притащить туда прикреплённую к ней РНК.
Известно, что аденовирус-содержащие векторы обычно предпочитают нервные клетки, поэтому Беверли Дэвидсон (Beverly L. Davidson) из Университета Айовы (University of Iowa) использует такие векторы для прицельной доставки РНК, которая нарушает работу гена, вырабатывающего белок хантингтин. В экспериментах на мышах такой подход даёт хорошие результаты, поэтому следующим шагом будут испытания на обезъянах.
Ещё один интересный способ доставки РНК в мозг использует группа Свами (Manhjunath N. Swamy) с медицинского факультета Гарвардского университета (Harvard Medical School). В ходе эксперимента РНК связывают с коротким пептидом, который выделен из вируса бешенства. Этот гликопротеин избирательно связывается с рецепторами к ацетилхолину на нервных клетках. Таким образом, siRNA оказывается на поверхности нейронов и получает возможность проникнуть внутрь. В опытах на животных этим способом удалось победить смертельный энцефалит. «Заякорить» РНК можно не только на белковых молекулах, но и на липидах или искусственных полимерах. Остаётся лишь убедиться, что такие «носители» нетоксичны для клеток.
Помимо доставки в труднодоступные органы, немало проблем создают побочные эффекты РНК-терапии. Трудность заключается в том, что побочное действие возможно адекватно проследить только в ходе применения нового лекарства на человеке: эксперименты на животных в этом случае дают лишь приблизительные знания либо выявляют только самые тяжелые побочные эффекты.
Несмотря на многие трудности, разработка РНК-терапии стоит того, ведь она позволяет влиять на работу органов на самом тонком уровне — на уровне генов. Изменение ситуации «в корне», на самых ранних ступенях — пока самый надёжный способ излечения от тяжёлых недугов, единственная надежда многих миллионов людей.
Источник: vokrugsveta.ru
