Профессор Кит Данкер (Keith Dunker), известный биохимик, работающий в Вашингтонском Государственном Университете (Washington State University), однажды, присутствуя на лекции кристаллографа Чака Киссинджера (Chuck Kissinger), рассматривал на слайде атомную структуру кальциневрина – фермента, являющегося мишенью для иммуносупрессивных препаратов. Ученый обратил внимание на то, что аминокислоты в одном из участков белка помечены пунктирной линией, что означает их вариабельность, что для белка в свою очередь значит отсутствие стабильной и упорядоченной пространственной организации. Докладчик говорил о том, что этот участок должен оставаться вариабельным для того, чтобы кальциневрин сохранял свои важнейшие функции в иммунной системе человека.
«Это поразило меня, - сказал Данкер, - Получается, этот участок белка не подчиняется общепринятой догме». Основным принципом молекулярной биологии является утверждение, что функция белка неразрывно связана с его его трехмерной структурой (принцип «Структура-Функция»). Ферменты связываются со специфическим субстратом, так как пространственные структуры фермента и субстрата идеально подходят друг другу, как ключ и замок. Но указанный участок кальциневрина, казалось, не подчинялся этому принципу: белок функционировал и без наличия стабильной структуры. Данкеру стало интересно выяснить, много ли еще существует подобных белков, игнорирующих «правила».
Чтобы выяснить это, Данкер с коллегами создали биоинформатическую программу, предсказывающую на основе аминокислотной последовательности белка, какие его участки «не упорядочены», то есть не имеют уникальной трехмерной структуры. На сегодняшний день уже создано множество таких программ, из данных которых становится очевидным, что около 40% всех белков человека содержат по крайней мере один неупорядоченный участок длиной от 30 аминокислот и более, а около 25% белков вообще не имеют уникальной пространственной организации [1]. Такие белки крайне мало изучены, так как их неупорядоченные участки плохо поддаются кристаллизации, следовательно, их структуру очень трудно изучить методом рентгеновской кристаллографии.
Ситуация изменилась после начала использования в исследованиях метода ядерной магнитно-резонансной (ЯМР) спектроскопии, позволяющей ученым определять структуру белков даже в растворах. Исследования показали, что неупорядоченность структуры белка может играть важную роль в его функционировании, помогая, например, сигнальным молекулам взаимодействовать с белками-партнерами, а регуляторным белкам - распознавать различные субстраты.
Несмотря на это, многие структурные биологи по-прежнему не видят необходимости в пересмотре центральной догмы молекулярной биологии. Ученые не доверяют компьютерным программам, используемым для прогнозирования неупорядоченных участков белка. Кроме того, исследователи утверждают, что белки с неупорядоченной структурой не могут существовать в клетке в течение долгого времени. Тем не менее накапливается все больше данных из самых разных областей биологии, таких как биофизика, биоинформатика и клеточная биология, говорящих в пользу «неупорядоченности» структуры многих белков, и сторонники этой теории призывают к полной переоценке парадигмы «Структура-Функция».
«Биологические системы используют неупорядоченность для осуществления разных функций», - говорит Питер Райт (Peter Wright), биофизик из Исследовательского Института Скриппса (Scripps Research Institute) (Калифорния, США).
«С конца 1950-х гг. считалось, что de novo синтезированные белки сразу же принимают нужную и единственную для них функциональную конформацию [2]. Несколько белков, известных отсутствием уникальной конформации, были отмечены, как исключения из правил», - вспоминает Райт. Но ситуация начала меняться в 1999 г., когда ученый опубликовал статью [3] с описанием большого количества белков, которые, казалось, функционировали, несмотря на их неупорядоченную пространственную структуру.
Научное сообщество продолжал волновать один животрепещущий вопрос: как белок может функционировать, если он не имеет четкой структуры? «Вопрос заключается в том, как происходит распознавание белка другими молекулами, - говорил структурный биолог Жоэль Жанин (Joel Janin) из Лаборатории Энзимологии и Структурной Биохимии Французского Национального Центра Научных Исследований (CNRS Laboratory of Enzymology and Structural Biochemistry) в Жив-сюр-Иветт, - Вся концепция «неупорядоченности» кажется несовместимой с моделью замка и ключа. Это все равно, что пытаться открыть дверь вареными спагетти».
В 2007 г. Кендзи Шугас (Kenji Sugase), ученый, работающий в лаборатории Райта, нашел ответ на интересующий всех вопрос: белок с неупорядоченной структурой использует «замок» (то есть белок-партнер) для подгонки собственной структуры под нужную форму «ключа». Шугас сконцентрировал свое внимание на белке CREB – транскрипционном факторе, регулирующем активность генов, участвующих во многих процессах, включая обучение и память. После связывания с определенным участком ДНК CREB-белку, прежде чем запустить экспрессию гена, необходимо распознать и связаться с белком-партнером CBP. Но один из участков CREB-белка начинает функционировать, еще не приняв упорядоченной структуры. Как это происходит?
Чтобы ответить на этот вопрос, Шугас разработал специальную ЯМР-камеру, способную с высокой частотой фиксировать изгибающиеся цепи CREB-белка в атомном разрешении. Это позволило изучить точки взаимодействия молекулы CREB с белком CBP, а также увидеть внутренние взаимодействия различных участков белка CREB. Ученый обнаружил, что до образования единого комплекса белков CREB и CBP между этими молекулами и внутри белка CREB образовывалось несколько связей [4]. Именно так происходит фолдинг обычного глобулярного белка: его внутренние участки образуют друг с другом долгосрочные химические связи, способствующие сворачиванию белка в нужную конформацию [2]. CREB-белок образует внутренние и внешние связи, взаимодействуя с белком CBP, и, если это взаимодействие слабее, чем нужно, комплекс не образуется. По мнению ученых, отсутствие четкой конформации выгодно CREB-белку, так как позволяет ему более успешно контактировать с белком-партнером, чем это делал бы белок с ригидной, жесткой структурой.
Догма «Структура-Функция» недавно получила еще один «удар в спину» от белка, в составе которого есть участки, вообще никогда не принимающие определенной конформации. Это сигнальный белок Sic1, являющийся ключевым регулятором клеточного цикла, ингибирующим репликацию ДНК до вступления клетки в нужную фазу цикла. В 2001 г. группа ученых под руководством Майка Тайерса (Mike Tyers) из Университета Торонто (University of Toronto) начала исследование механизма работы этого белка.
Известно, что при переходе клетки в синтетическую фазу цикла (когда начинается процесс репликации ДНК и синтеза белков), белок Sic1 разрушается. Предварительным условием для деструкции Sic1 является его фосфорилирование (присоединение к определенным участкам белка фосфатных групп). Это ведет к тому, что Sic1 распознается клеточным аппаратом белковой деградации благодаря работе белка Cdc4. Тайерс с коллегами выяснили, что белок Sic1 нуждается по крайней мере в 6 фосфорилированных участках, прежде чем он свяжется с Cdc4 [5].
После нескольких неудачных попыток кристаллизовать белок Sic1 для выяснения его структуры методом рентгеновской кристаллографии, ученые решили воспользоваться ЯМР-спектроскопией, которая показала, что Sic1 не просто «неупорядочен», но в принципе не имеет определенной конформации, даже будучи связанным с Cdc4. Белковый комплекс постоянно принимал различные конформации. Самим потрясающим было то, что все шесть фосфатных групп белка Siс1 при взаимодействии с Cdc4 всегда находились в одном и том же участке связывания независимо от структуры всего комплекса.
Получив компьютерную модель белка, ученые пришли к выводу, что, хотя Siс1 не имеет определенной конформации даже при связывании с Cdc4, он все же обладает довольно компактной структурой, позволяющей держать все фосфатные группы белка довольно близко друг к другу для формирования среднего электростатического поля, удерживающего белки Sic1 и Cdc4 вместе. Только при наличии 6 фосфатных групп силы, соединяющие 2 белка, становятся достаточными, чтоб Cdc4 запустил разрушение белка Sic1. По мнению ученых, одна из причин того, что белку Sic1 приходится быть неупорядоченным, заключается в том, что ригидной молекуле Cdc4 необходимо иметь доступ ко всем участкам белка, чтобы присоединить к ним определенные химические группы, сигнализирующие внутриклеточным системам деградации белков, что молекула Sic1 должна быть разрушена.
Белок опухолевой супрессии р53 имеет глобулярный домен с четкой пространственной организацией (помечен на рисунке коричневым цветом). Неупорядоченные участки (разноцветные) способствуют взаимодействию белка с сотнями белков-партнеров (изображение: M. BLACKLEDGE/IBS GRENOBLE)
Белок опухолевой супрессии р53 является центральным звеном многих сигнальных путей в клетке, из-за чего нарушение его функций связано с развитием многих онкологических заболеваний. Этот белок также содержит участки, не имеющие постоянной конформации. Кроме того, разные участки белка имеют разные конформации: от строго определенных до полностью неупорядоченных. Основной домен белка p53 – глобулярный – имеет четкую пространственную организацию и предназначен для связывания с ДНК и с несколькими белками. Соседние домены не упорядочены и могут связываться с тысячами сигнальных молекул. Один из этих доменов содержит так называемый «участок-хамелеон», который может принимать 4 различных конформации в зависимости от молекулы, с которой он взаимодействует [8].
Многие ученые интересуются вопросом о том, насколько распространены неупорядоченные белки. Биохимики с трудом верят в то, что такие белки могут долго существовать в клетке, выполнять свои функции и при этом не разрушаться специальными ферментами – протеазами, расщепляющими белки с аномальной структурой. Однако исследователи, работающие в этой области, уверяют, что такие опасения необоснованны. В клетках человека неспецифические протеазы находятся в специальных органеллах – лизосомах, что должно предохранять неупорядоченные белки от уничтожения.
Важным моментом также является то, что неупорядоченные белки защищены от агрегации, т.е. от «слипания» друг с другом, потому что, в отличие от глобулярных белков, они содержат очень мало гидрофобных аминокислот, имеющих тенденцию «слипаться» друг с другом, и, наоборот, богаты «полярными» аминокислотами, способствующими растворению этих белков в воде. Ученые считают, что естественный отбор против агрегации обеспечил неупорядоченным белкам такой особенный аминокислотный состав.
В настоящее время все большее число кристаллографов во избежание проделывания ненужной работы полагается на многочисленные компьютерные программы, обещающие 80% точность в определении неупорядоченных участков белка.
Возможно, длительные дебаты о распространенности и важности белков с неупорядоченной пространственной организацией замедлили развитие этой области биологии. DisProt, база данных белков, чья «неупорядоченность» была установлена экспериментально, содержит информацию более чем о 500 молекулах, - это гораздо меньше, чем 60 000 белков из базы данных Protein Data bank, содержащей информацию о белках, которым присуща стабильная трехмерная структура.
«База DisProt так мала, потому как в течение долгих лет она не могла получить финансирование, - говорит Данкер, - Но в последние годы во многих странах были созданы консорциумы с целью изучения неупорядоченных белков. Интерес к этим белкам сейчас на подъеме, так как многие из них играют важную роль в развитии заболеваний человека».
Мало-помалу вырисовывается принципиально новая картина взаимоотношений между аминокислотной последовательностью белка, его структурой и функцией: это касается как белков-ферментов, имеющих четкую пространственную организацию и взаимодействующих с белками-партнерами по принципу замка и ключа, так и белков, вообще не имеющих стабильной структуры, наподобие белка Sic1. Для выяснения механизмов работы всех этих белков исследователям еще предстоит проделать огромную работу.
Источник: cbio.ru
Оригинальный текст: Tanguy Chouard
По материалам:
NatureNews
Литература:
1. Uversky, V. N. & Dunker, A. K. Biochim. Biophys. Acta 1804, 1231-1264 (2010).
2. Anfinsen, C. B. Science 181, 223-230 (1973).
3. Wright, P. E. & Dyson, H. J. J. Mol. Biol. 293, 321-331 (1999).
4. Sugase, K., Dyson, H. J. & Wright P. E. Nature 447, 1021-1025 (2007).
5. Nash, P. et al. Nature 414, 514-521 (2001).
6. Mittag, T. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 105, 17772-17777 (2008)
7. Mittag, T. et al. Structure 18, 494-506 (2010)
8. Oldfield, C. J. et al. BMC Genomics 9 (Suppl. 1), S1 (2008)
